ES細胞のin vitro分化系を用いた膵β細胞生成の試み

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12671113
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 谷澤 幸生 山口大学, 医学部・附属病院, 講師 (00217142)
• 研究分担者: 佐々木 輝昌 山口大学, 医学部・附属病院, 医員(臨床) ; 湯尻 俊昭 山口大学, 医学部, 日本学術振興会特別研究員(PD) ; 黒川 和良 山口大学, 医学部・附属病院, 医員(臨床)
• キーワード: ES細胞 / β細胞 / インスリン / 分化 / 糖尿病

研究概要

胚性幹細胞(ES細胞)は初期胚由来の多分化能をもつ細胞で,in vitroで造血細胞,神経細胞,心筋細胞などに分化誘導が可能なことが示されている.今回,膵β細胞への分化誘導法を確立することを目指して研究を開始した.種々の細胞系列へと分化するES細胞から膵β細胞へ効率的に分化を誘導し,純化するためには分化したβ細胞を選択するためのマーカーが必要となる.そこで,膵の分化初期に転写が開始され,発生の進行とともにβ細胞に限局した発現が認められる転写因子IPF-1/Pdx1遺伝子,及び,β細胞で特異的に発現されるインスリン遺伝子のプロモーターの下流でzeocin耐性遺伝子およびEGFP遺伝子がpolycystronicに発現されるレポーター遺伝子を作成した(IPF-1-zeo-ires-EGFP及びRIP-zeo-ires-EGFP).これらのレポーター遺伝子がβ細胞株であるMIN6細胞で発現されることを確認した.そこで,このレポーター遺伝子をゲノム内に安定に組み込んだES細胞を作成した.この細胞では,β細胞へと分化を開始するとEGFPを発現し,EGFPの発する蛍光により蛍光顕微鏡下で同定可能となる.同時に,セルソーターや抗生剤zeocinでの選択により細胞を純化することも可能である.現在これらの細胞を用いて,hanging drop法を用いてEmbryoid bodyを産生し,インスリン産生細胞への分化の条件を検討中である.ES-IPF-1-zeo-ires-EGFP細胞をLIF非存在下でspontaneousに分化させる条件では,IPF-1プロモーターがactiveとなり,EGFPによる蛍光が蛍光顕微鏡下で確認される細胞の頻度は低く,ES-RIP-zeo-ires-EGFP細胞とあわせてさらに分化条件の検討を行っている.

研究成果

• [文献書誌] Takeda K: "WFS1 (Wolfram syndrome 1) gene product : predominant subcellular localization to endoplasmic reticulum in cultured cells and neuronal expression in rat brain."Human Molecular Genetics. 10. 477-484 (2001)
• [文献書誌] Matsuo M: "Functional analysis of a mutant sulfonylurea receptor, SUR1-R1420C, that is responsible for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy."J Biol Chem. 275. 41184-41191 (2000)
• [文献書誌] Tanizawa Y: "Genetic Analysis of Japanese Patients with Persistent Hyperinsulinemic Hypoglycemiao Infancy. NBF-2 mutation impairs cooperative binding of adenine nucleotides to SUR1"Diabetes. 49. 114-120 (2000)