| 研究概要 |
DPC4(Deleted in Pancreas Carcinoma,Locus4)遺伝子は1996年、ジョンズホプキンス大学S.E.Kern博士により、クローニングされたが、DPC4/Smad4,cDNA遺伝子(pDPC4-wt3,4.4kb)をS.E.Kern博士より提供を受け、E.Coliを用い,pBluescript II SK(+)phagemidの形で遺伝子を複製した。それをBamH1(Start codonより10塩基)EcoR1(Stop codonより18塩基)で切断しDPC4/Smad4 cDNA(1660bp)を回収しし、アデノウイルス発現ベクター作成用コスミッドDNAにDPC4/Smad4,cDNA遺伝子を、In-vitro Packageを用いて逆向きに組み込んだ。このコスミッドDNAをEco T22Iに切断された親アデノウイルスと293細胞にco-transfectし、組換えウイルスを分離しDPC4/Smad4発現アデノウイルスベクターを作製する作業を繰り返し行っているが、未だ完成に至っていない。次年度は、このベクターが完成されたならば、細胞培養系による検討(In vitro)としてDPC4/Smad4のhomozygous deletionが確認された膵癌培養細胞株;HS766T,Capan-1に対し、アデノウイルスベクターによりDPC4/Smad4遺伝子導入を行い、これよりmRNA、タンパクを抽出し、Northern,Western Blot Hybridizationを行い、実際にDPC4/Smad4のmRNA,タンパク発現が見られるか否かを検討したい。さらに、すでに作成済みのp16アデノウイルスベクターをこれら膵癌細胞にco-transfectすることにより、どの程度の細胞増殖抑制効果が得られるかを検討したい。
|
