| 研究概要 |
1)心筋細胞の収縮と細胞内カルシウム([Ca^<2+>]i)の同時測定:担当 金谷、関
単離心室筋細胞は成熟ラット()心臓より酵素法を用いて分離した。心筋細胞収縮と[Ca^<2+>]iの同時測定のため、心筋細胞に蛍光色素(fura-2/AM,2μM)を37℃で20分間負荷した。心室筋細胞を温度を一定(28℃)にしたチャンバーに入れ、Nikon TE300倒立式蛍光顕微鏡で観察した。単離心筋細胞は、HEPES-buffered saline(HBS)で持続的に灌流した。心収縮を誘発するため双極電極を用いて、0.3Hzで電気刺激を行った。
単離心筋細胞の蛍光測定は2波長蛍光分析器(RF-D4012,ex.340/380;em.510nm)を用いて行った。[Ca^<2+>]iの測定は細胞を含まない既知濃度のCa^<2+>を含むbuffer中にfura-2(free acid)を入れ、その際の蛍光比により測定によって得られた蛍光比を[Ca^<2+>]iとして換算した。[Ca^<2+>]iと細胞収縮の同時測定のために、心筋細胞は同時に600nmの赤色光にさらし細胞長の変化をvideo edge detectorで観察した。細胞長の測定のためにvideo edge detectorを顕微鏡上でmicrometerを用いてキャリブレーションを行った。
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