| 研究概要 |
免疫組織染色
(方法)
ヒトRXcDNAをpGEX発現ベクターに組み込み、バクテリアでGST-RX融合蛋白を作成、精製し、ウサギにアジュバントとともに注射し、ポリクロナル抗体を作製した。ラット眼球をパラフィン固定し、Vector社のAEC kitにて免疫染色を行った。
(結果)
RX蛋白は網膜のouter nuclear cell layer, ganglion cell layer, inner nuclear cell layer に存在し、photoreceptor cellだけでなく、広く網膜全体に分布していることがわかった。
CAT assayによるプロモーター活性
(方法)
マウスアレスチンプロモーターおよびマウスIRBPプロモーターをpSVCATに組み込みレポータージーンを作成する。RX、CRXをpCDNA3に組み込みこれを発現ジーンとし、293 cellにco-transfectし培養する。3日後に細胞をホモジナイズし得られた、蛋白を用いてCAT assayを行った。
(結果)
アレスチン、IRBPプロモーターともRX, CRXをtransfectすることによりdose dependentにプロモーター活性の上昇を見た。またRX, CRXを同時にtransfectするとsinergicにプロモーター活性を上昇させた。このことから、RX, CRXは協調的に網膜特異的なプロモーターを活性化していることがわかった。次年度はRX, CRXが本当にPCE1,OTX site特異的に結合し、プロモーター活性を上昇させているのか、新しいconstructやmutantを作成して、研究を行う予定である。
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