| 研究概要 |
CAT assayによるRX, CRXの特異的シス領域の活性化
目的:平成14年の実験でCAT assay法を用いてRX, CRXがアレスチンおよびIRBPのプロモーターを活性化することを明らかにした。アレスチンやIRBPのプロモーターにはRXが結合するPCE-1サイト(CAATTAG)とCRXが結合するOTXサイト(TGATTAA)が存在する。今年度の実験はRXとCRXが特異的にそれぞれの領域に結合して活性化することを明らかにすることにある。
方法:プロモーターをCAT上流に組み込みレポータージーンを作成する。RX、CRXをpCDNA3に組み込みこれを発現ジーンとし、293 cellにco-transfectし培養する。3日後に細胞をホモジナイズし得られた、蛋白を用いてCAT assayを行った。
結果:まずマウスアレスチンプロモーターのPCE-1サイトCAATTAGをCAACCAGに変えたものをpsvCATに組み込みレポータージーンとしてCAT assayを行うとCRXで活性化するもののRXでプロモーターは活性化されなかった。さらにtkプロモーターを上流に持つCATジーン(pTKCAT5)にPCEサイトおよびOTXサイトを2個ずつtandemに組み込んでCAT assayを行った。PCE-1を組み込んだレポータージーンはRXが、OTXを組み込んだものはCRXがそれぞれ特異的に活性化することが示された。
結論:このことにより我々が過去に行った結合実験と組み合わせて考えると、アレスチン、IRBPのプロモーターにあるPCE1,OTXというシス領域に転写因子RX, CRXがそれぞれの特異的に結合し活性化していることが明らかになった。
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