| 研究概要 |
1.ROS17/2.8骨芽細胞様細胞に1-34副甲状腺ホルモン(PTH;10^<-8>M)またはFGF2(10ng/ml)を添加後,全RNAを抽出しノーザンブロットを行った結果,PTHは添加6時間後にBSPmRNAの発現を約5倍,FGF2は約4倍に上昇させた。一方,両因子はBSPmRNAの分解速度には影響を与えなかった。
2.ルシフェラーゼプラスミドに,長さを調節したBSPプロモーターを挿入し,ROS17/2.8細胞に導入後,PTHまたはFGF2で刺激したところ,BSP遺伝子プロモーターの-116塩基対上流域までを含むコンストラクトでルシフェラーゼ活性が上昇した。この配列中には,逆方向のCCAAT配列,cAMP応答配列(CRE)および下垂体特異的転写因子(pituitary specific transcription factor-1; Pit-1)結合配列が存在する。Pit-1配列の上流約半分を欠失したコンストラクトでは,PTH刺激でルシフェラーゼ活性の上昇が認められなかったことから,Pit-1配列を介してPTHによる転写の調節が行われていると考えられた。また,転写開始点から-92〜-85塩基対上流までの配列中に変異を導入すると,FGF2刺激に応答しなくなることから,同配列をFGF2応答配列(FRE)と命名した。
3.BSPプロモーター中のPit-1配列およびFRE配列をアイソトープで標識し,ゲルシフトアッセイにて核内タンパク質との結合性の検索を行った結果,Pit-1配列およびFRE配列とROS17/2.8細胞核内タンパク質との複合体が観察された。Pit-1配列と核内タンパクの複合体はPTH刺激により減少し,FRE配列と核内タンパクの複合体はFGF2刺激により増加することが明らかになった。以上の結果は,PTHおよびFGF2によるBSPの転写の調節は,転写因子結合配列に結合する核内転写因子が減少または増加することにより行われていることを示唆していた。
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