| 研究概要 |
In situ hybridizationを用いてマウス歯胚でのターゲット遺伝子発現を明らかにした。試料としてC57BL6マウス胚、E11.5,El3.5,E15.5を解剖し取り出した。これらのマウス胚を固定し、第一臼歯胚の組織切片を作製した。また加えて上顎切歯胚を含む組織切片を作成した。In situ hybridizationプローブはターゲット遺伝子のRNAプローブを作製した。方法は、E15.5の第一臼歯胚とその周囲組織からmRNAを抽出し、ターゲット遺伝子のmRNA配列からオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、RT-PCRによりcDNAを作製した。このcDNAをpBluescriptKS(Stratagene)に挿入し、センスおよびアンチセンスRNAプローブを作製した。In situ hybridizationは、RNAプローブをDIG RNA labeling Mix(Boehringer Mannheim)で標識し、アルカリホスファターゼ標識抗DIG抗体(Boehringer Mannheim)で検出し、NBT/BCIP(Boehringer Mannheim)で発色させた。しかしAP2a,fkh6,TCF1,Sna,Sp4,の5種の遺伝子に関しては良好なシグナルが得られず、新たな遺伝子Embryo Brain Kinase(Ebk)をターゲットとした。同様な方法でIn situ hybridizationを行い、E13.5においては第一臼歯胚および上顎切歯胚の歯胚を取り巻く間葉組織においてEbkの発現がみられた。また一次口蓋の間葉組織にも強いシグナルがみられた。第一臼歯、上顎切歯ともに歯胚の上皮組織にはEbkの発現は見られなかった。E15.5においてはE13.5と同様に第一臼歯胚および上顎切歯胚の歯胚を取り巻く間葉組織においてEbkの発現がみられ、歯胚の上皮組織においてはシグナルはみられなかった。また口蓋においてはE13.5よりも発現が弱かった。E11.5におけるIn situ hybridizationは現在進行中である。
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