二次元電気泳動及びLC/MS/MSによる糖タンパク質糖鎖の構造と機能解析法の開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12672102
• 研究機関: 国立医薬品食品衛生研究所
• 研究代表者: 川崎 ナナ 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 研究員 (20186167)
• キーワード: LC / MS / LC / MS / MS / precursor scan / 糖タンパク質 / 糖鎖 / トロンボモジュリン

研究概要

【目的】本研究の目的は、疾患等に関与する糖タンパク質を探索し、その糖鎖の構造と機能を明らかにするために、LC/MS及びLC/MS/MSを用いた、二次元電気泳動法で分離精製された糖タンパク質糖鎖の迅速・簡便・高感度な糖鎖解析法を開発することである。本年度は、モデル糖タンパク質及び糖鎖としてトロンボモジュリン及び標準糖鎖を用いて、微量糖タンパク質の糖鎖構造解析法の開発を検討した。
【実験及び結果】トロンボモジュリンをトリプシンで消化し、ペプチド混合物をミクロカラムMAGIC C18(1.0×150mm)で分析した。ペプチドマップ上糖ペプチドは、糖鎖の構造が未知であることに加え、糖鎖が不均一性を示すことから特定が困難になることが多い。そこで、糖ペプチドを識別するために、特定のフラグメントを持つ親イオンだけを測定するLC/MS/MSのprecursor scanを検討した。N結合糖鎖の一部NeuAc-Gal-GlcNAc(m/z657)とGal-GlcNAc(m/z366)を有するペプチドの検出を行ったところ、4本のピークのみが検出され、N結合糖鎖結合ペプチドを特定することができた。また、結合している糖鎖はフコシルバイアンテナ型で、シアル酸結合数に不均一性があることが明らかになった。
さらに詳細に糖鎖の分布と構造を解析するためには、糖鎖を切り出し、先に報告したLC/MSによる糖鎖マッピングを行う必要がある。そこで、標準糖鎖を用いて、ミクロLC/MSによる糖鎖マッピングを検討し、微量糖鎖の分析にも応用できることを確認した。
【考察】ミクロLC/MS/MSによって、N結合糖鎖が付加したペプチドの同定が可能であること、また、ミクロLC/MSによる糖鎖マッピングは、微量糖鎖の解析に有用であることを確認した。今後は、さらに複雑な糖鎖の解析に応用できることを確認する必要があると思われる。

研究成果

• [文献書誌] Nana KAWASAKI: "Application of liquid chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography with tandem mass spectrometry to the analysis of sitespecific carbohydrate heterogeneity in erythropoietin"Anal.Biochem. 285. 82-91 (2000)
• [文献書誌] Miyako OHTA: "Selective glycopeptide mapping of erythropoietin by on-line high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry"J.Chromatogr.A. 910. 1-11 (2001)
• [文献書誌] Yasuo ODA: "Crocus sativus lectin recognizes (Man)_3 GlcNAc in the N-glycan core structure"J.Biol.Chem.. 275. 26772-26779 (2000)
• [文献書誌] Takao HAYAKAWA: "Current Analytical Procedures for Glycosylated Proteins"Pharmaeuropa Special Issue, Proceedings Biologicals Beyond 2000. 87-102 (2000)
• [文献書誌] Osamu HASHIMOTO: "Difference between follistatin isoforms in the inhibition of activin signalling : Activin neutralizing activity of follistatin isoforms is dependent on their affinity for activin"Cell.Signal.. 12. 565-571 (2000)
• [文献書誌] Sumiko HYUGA: "Possible Role of Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor and Activin A Produced by the Target Organ in Liver Metastasis"Cancer Lett.. 153. 137-143 (2000)