|
放線菌が生産する抗HIV活性を有する蛋白質actinohivin(AH)の分子構造と活性の関係の解明とその成果に基づいた新しい低分子抗HIV薬創製の為の基盤研究を実施し、本年度下記の結果を得た。
1.AH生産菌よりクローニングしたAH遺伝子を鋳型としてPCR法でAH構造遺伝子を増幅し、これを大腸菌発現ベクターpET30Xa/LICのクローニング部位とin frameで連結してAH発現プラスミドpET30Xa/LIC::AHを構築した。
2.このプラスミドで大腸菌BL21plysS(DE3)を形質転換し、得られた組み換え体をIPTGで発現誘導したところ、約20mg/Lの組み換え融合AHが生産された。
3.組み換えAHの精製法を検討し、大腸菌の粗抽出液をNiキレートカラムおよび逆相シリカゲルカラムを用いたクロマトグラフィーで組み換え融合AHを精製した後、プロテアーゼ ファクターXaで消化して組み換えAHを分離し、これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する方法を確立した。
4.この方法で得られた組み換えAHは放線菌より得られたAHと同等のシンシチウム形成阻害活性を示した。
5.組み換えAHを簡便な方法で分離・精製するために大腸菌のシグナルペプチド配列を利用した組み換えAH分泌発現系を大腸菌分泌発現ベクターpET26を用いて構築した。
組み換えAHの大腸菌による生産および精製方法が確立されたので、次にAHの種々の欠失変異体を大腸菌で作成しそれらの抗HIV活性を評価し、AHの抗HIV活性必須領域を明らかにする。
|
