| 研究概要 |
1.中国マムシ血清から3種のPLA_2阻害タンパク質の大量精製と結晶化
既に確立した精製方法を用いて、約30mlの中国マムシ血清からPLIα,PLIβ,PLIγを精製している。これらの精製した阻害タンパク質についてHanging Drop法を用いて結晶化の条件を検討中である。現在のところ、PLIαについては針状結晶が得られ、X線結晶解析に適した結晶を得るよう結晶化条件を至適化している。PLIγについては沈殿を生じ、結晶は得られていない。
2.PLA_2阻害タンパク質の部位特異的変位導入を用いた構造活性相関
PLIαに関して我々が確立している発現系を用いて中国マムシPLIαとシマヘビ由来のPLIαホモログとのキメラタンパク質を作成し、PLA_2阻害活性を測定した。その結果、中国マムシPLIαの13〜34位が中国マムシ酸性PLA_2に対する阻害活性に重要であることがわかった。この領域のうちAsn-26をLysに置換した変異体N26Kにおいて阻害活性の顕著な低下が見られた。すなわちPLIαに存在するCRD様配列は必ずしもPLA_2との相互作用に直接かかわるのではなく、PLIαの3量体構造の保持などの構造的な基盤としての役割を果たしており、PLA_2との相互作用にはCRD以外のN末端領域が必要であると考えている。
3.PLA_2と阻害タンパク質との相互作用
中国マムシ酸性PLA_2を固定化したセンサーチップを用いて、表面プラズモン共鳴を測定することによって、PLIαとの相互作用を測定した。その結果、Ca^<2+>によって結合速度および解離速度は影響を受けず、PLIαとPLA_2との相互作用にCa^<2+>は全く関与しないことが明らかとなった。また、基質アナログであるアルキルホスホコリンの存在下で、PLA_2に対するPLIαの結合速度の低下と解離速度の上昇が見られ、PLIαはPLA_2の基質結合部位に結合することが推測された。
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