細胞内脂質ドメインの構成とダイナミクスの分子解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12672143
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 小林 俊秀 理化学研究所, スフィンゴ脂質機能研究チーム, チームリーダー(研究職) (60162004)
• 研究分担者: 牧野 麻美 理化学研究所, スフィンゴ脂質機能研究チーム, テクニカルスタッフ(研究職)
• キーワード: スフィンゴ脂質 / コレステロール / リゾビスホスファチジン酸 / エンドソーム / 脂質ドメイン / ラフト / スフィンゴリピドーシス / ライセニン

研究概要

脂質ラフトはスフィンゴ脂質(スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質)とコレステロールの集合体であり、生体膜上ではリン脂質が形成する不規則な二次元平面上に比較的規則正しく配列した「ドメイン」と呼ばれる微小領域を形成していると考えられている。脂質ラフトの動態についてはわからないことが多いが、これは主として脂質ラフトそのものを追跡する手段が乏しいことに起因している。糖脂質合成欠損株を用いた最近の解析結果は、脂質ラフトの形成にはスフィンゴ脂質としてスフィンゴミエリンの存在が必要十分であることを示唆している。
シマミミズ体腔液から精製された毒素・ライセニンは297アミノ酸からなるタンパク質で、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細胞死を引き起こす。我々はリコンビナントライセニンを用い、細胞内のスフィンゴミエリンの分布を免疫電子顕微鏡法により解析した。その結果スフィンゴミエリンは形質膜、トランスゴルジネットワーク、早期エンドソーム、エンドソームキャリアー小胞および後期エンドソームに分布していることが示された。スフィンゴミエリンはゴルジ体で合成されるにもかかわらず、ゴルジ体にはスフィンゴミエリンは検出されなかった。スフィンゴミエリンの分布は提唱されている脂質ラフトの分布と良く一致する。また基質への細胞接着に伴う細胞表面でのスフィンゴミエリンの動態を蛍光抗体法によって調べた結果、接着初期のラフリングの際にはスフィンゴミエリンはアクチンと挙動を共にするが、細胞接着後は両者は分離することが示された。
ライセニンは6個のトリプトファンを含んでいる。各々のトリプトファン(W)をアラニン(A)に置換した変異体を作製したところ、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、毒性を持たない変異体(W20A)を得ることができた。この変異体を用いることにより、生きた細胞での脂質ラフトの解析が可能になった。

研究成果

• [文献書誌] Kobayashi,T.: "The tetraspanin CD63/lamp3 cycles between endocytic and secretory compartments in human endothelial cells"Mol.Biol.Cell. 11 . 1829-1843 (2000)
• [文献書誌] Chevallier,J.: "Rapid access to synthetic lysobisphosphatidic acids using PIII chemistry"Org.Lett.. 2. 1859-1861 (2000)
• [文献書誌] Nomura,K.: "Peroxidation of cardiolipin triggers release of cytochrome c in hypoglycemia induced apoptosis"Biochem.J.. 351. 183-193 (2000)
• [文献書誌] Kobayashi,T.: "Localization of lysobisphosphatidic acid-rich membrane domains in late endosomes"Biol.Chem.. (In press).
• [文献書誌] Kobayashi,T.: "Lipid domains in the endocytic pathway"Sem.Cell Develop.Biol.. (In press).
• [文献書誌] Kobayashi,T.: "Lipid membrane domains in cell surface and vacuolar system"Glycoconj.J.. (In press).