新規遺伝子治療薬創製のための発現調節機能を備えた安定な外来遺伝子発現系の開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12672145
• 研究機関: 国立医薬品食品衛生研究所
• 研究代表者: 早川 堯夫 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 部長 (50124392)
• 研究分担者: 水口 裕之 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 研究員 (50311387)
• キーワード: 遺伝子治療 / アデノウイルスベクター / アデノ随伴ウイルス / 発現調節能

研究概要

遺伝子治療が21世紀の革新的医療技術と位置づけられることは、ゲノム解析の進展とその成果の応用ともあいまって明らかである。この遺伝子治療を普遍的なものとしていくためには、目的遺伝子を必要な細胞に効率よく導入し、遺伝子発現を必要な期間、必要な程度に発現させることができ、かつ安全性も高いベクターおよび遺伝子発現系の開発が必要不可欠である。本研究では、アデノ随伴ウイルス(AAV)がヒト染色体の安全な領域へ部位特異的に遺伝子を組み込む能力を有することに着目し、その機能を担う特定の塩基配列を利用することによる目的遺伝子及び遺伝子発現調節領域の染色体への導入と長期遺伝子発現系の構築に関する技術開発を目指す。本年度は以下の結果を得た。
1)ラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーターの下流にhAAT cDNAを組み込み、遺伝子導入細胞の選択のためにネオマイシン耐性遺伝子、トランスフェクション効率の指標のためにルシフェラーゼとGFPの融合遺伝子をもったベクターを作製した(phAAT-ELN)。さらに、これらの遺伝子の両端にAAV ITR(inverted terminal repeat)配列をもったベクターを作製した(pAAV-hAAT-ELN)。現在、RSVプロモーター・hAATカセットをhAATゲノムDNA(19Kb)に置き換えたベクターを作製している。
2)PhAAT-ELN、pAAV-hAAT-ELNを動物細胞に作用させることによりhAAT、ルシフェラーゼ、GFPを発現することを確認した。現在、AAV配列の付加による染色体へのインテグレーション能について検討している。

研究成果

• [文献書誌] H.Mizuguchi,N.Koizumi,T.Hosono,N.Utoguchi,Y.Watanabe,M.A.Kay,T.Hayakawa.: "A simplified system for constructing recombinant adenoviral vectors containing heterologous peptides in the HI loop of their fiber knob"Gene Ther.. (in press).
• [文献書誌] N.Okada,Y.Tsukada,S.Nakagawa,H.Mizuguchi,K.Mori,T.Saito,T.Fujita,A.Yamamoto,T.Hayakawa,T.Mayumi.: "Efficient gene delivery into dendritic cells by fiber-mutant adenovirus vectors."Biochem.Biophys.Res.Commun.. (in press).
• [文献書誌] 水口裕之,早川堯夫: "アデノウイルスベクター作製技術と次世代ベクターへの応用-ファイバーミュータントアデノウイルスベクターを中心として-"日本臨床. 58. 1544-1553 (2000)
• [文献書誌] H.Mizuguchi,Z.Xu,A.Ishii-Watabe,E.Uchida,T.Hayakawa: "IRES-dependent second gene expression is significantly lower than cap-dependent first gene expression in a bicistronic vector."Mol.Ther.. 1. 376-382 (2000)
• [文献書誌] Y.Nagayama,E.Nishiara,H.Namba,H.Yokoi,M.Hasegawa,H.Mizuguchi,T.Hayakawa,H.Hamada,S.Yamashita,M.Niwa.: "Targeting the replication of adenovirus to p53-defective thyroid carcinoma with a p53-regulated cre/loxP system."Cancer Gene Ther.. 8. 36-44 (2001)
• [文献書誌] H.Mizuguchi,T.Hosono,,T.Hayakawa: "Long-term replication of Epstein-Barr virus-derived episomal vectors in the rodent cells."FEBS Letter. 472. 173-178 (2000)