マイクロチツプキャピラリー電気泳動による遺伝子診断

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12672252
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 荒川 秀俊 昭和大学, 薬学部, 助教授 (70129807)
• 研究分担者: 伊藤 克敏 昭和大学, 薬学部, 講師 (20223141) ; 前田 昌子 昭和大学, 薬学部, 教授 (00053869)
• キーワード: マイクロチップキャピラリー電気泳動 / マイクロチップ / ベロ毒素遺伝子 / SSCP / 腸管出血性大腸菌 / 遺伝子診断 / PCR

研究概要

本年度の研究ではプラスチック板上に構築したマイクロチャンネルを用いた電気泳動システムを用いて、迅速で高い特異検出を有する一本鎖高次構造多型解析ついて検討した。対象遺伝子は、ベロ毒素遺伝子VT1とVT2について検討した。
【方法】電気泳動:装置は2cmx7cmのプラスチック板上に作製した幅100μm、深さ30μmの溝の末端に電極を配置し、共焦点検出法を用いる蛍光検出器からなる。泳動液はpH8.2のTBE緩衝液にソーンゲルと5μg/mlエチジウムブロマイドを添加した溶液を用いた。
【成果】最初に本装置を用いて二本鎖DNA断片(72bp〜1353bp)の分離条件について検討した。その結果、5%ソーンゲル、750volts、泳動距離3cmの条件で、約150秒という短時間で分離が達成された。次に、本法をベロ毒素遺伝子(VT1とVT2)検出でのsingle strand DNA conformation polymorphismのPCR条件ならびにマイクロチップによる分離法を検討した。その結果、VT1とVT2遺伝子の同領域の169bp断片を特異的に増幅するPCRを構築することができた。また分離ではソーンゲル濃度、分離pH、泳動温度、泳動溶液について詳細に検討した。その結果、方法に述べたゲル濃度、温度20℃でVT1とVT2を明瞭に分離することができた。本測定システムは、従来の電気泳動と比べ解析時間が百分の一の短時間で解析が可能出あった。したがって、迅速な対応を必要とする感染症などの遺伝子診断には極めて有効な方法である。次年度は、発光検出によるマイクロチップの高感度化、さらにポストゲノムとして期待されている薬物代謝遺伝子多型などのSNP解析について検討を行う予定である。

研究成果

• [文献書誌] Hidetoshi Arakawa, et al.: "Detection of two variant Vero toxin genes in Escherichia coli by capillary electrophoresis"Biomedical Chromatography. 16. 41-46 (2002)
• [文献書誌] Hidetoshi Arakawa et al.: "Single-strand conformation polymorphism analysis of Vitamin D receptor gene by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection"Analytica Chimica Acta. 445. 197-204 (2001)
• [文献書誌] Kazuyuki Watanabe, et al.: "Simultaneous analysis of two-site gene polymorphisms using time-resolved fluorescence immunoassay"Analytical Sciences. 16. 765-769 (2000)
• [文献書誌] Amane Kokado, et al.: "New electrochemical assay of alkaline phosphatase using ascorbic acid 2-phosphate and its application to enzyme immunoassay"Analytica Chimica Acta. 407. 119-125 (2000)
• [文献書誌] Mahina Kanemitsu, et ak.: "Chemiluminescent determination of lucigenin using thioureid derivatives"Analytica Chimica Acta. 403. 125-130 (2000)
• [文献書誌] Hidetoshi Arakawa, et al.: "Bioluminescent PCR-RFLP enzyme-linked immunosorbent assay for analysis of vitamin D receptor gene polymorphism"Analytical Sciences. 15. 943-949 (1999)