マイクロチップキャピラリー電気泳動による遺伝子診断

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12672252
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 荒川 秀俊 昭和大学, 薬学部, 助教授 (70129807)
• 研究分担者: 伊藤 克敏 昭和大学, 薬学部, 講師 (20223141) ; 前田 昌子 昭和大学, 薬学部, 教授 (00053869)
• キーワード: マイクロチップキャピラリー電気泳動 / マイクロチップ / う食細菌 / Duplex PCR / 遺伝子診断 / S.mutanns / S.sobrinus

研究概要

本年度の研究ではプラスチック板上に構築したマイクロチャンネルを用いた電気泳動システムを用いて、迅速で高い特異検出を有する虫歯予防での遺伝子診断法について検討した。対象遺伝子は、虫歯菌のS.mutannsとS.sorubrinus遺伝子について検討した。
【方法】電気泳動:装置は2cm×7cmのプラスチック板上に作製した幅100μm、深さ30μmの溝の末端に電極を配置し、共焦点検出法を用いる蛍光検出器からなる。泳動液はpH8.2のTBE緩衝液にソーンゲルと5μg/mlエチジウムブロマイドを添加した溶液を用いた。口腔内から採取した歯垢に蛋白分解酵素を加え処理後、DNAをフェノールで抽出し、S.mutannsとS.sobrinusのDuplex PCR又はSingle PCRを用いて増幅し、マイクロチップ電気泳動で解析した。
【成果】S.mutansとS.sobrinusを特異的にかつ高感度に検出するため、これら菌に存在するdex遺伝子のPCR増幅法を開発した。方法としては、2菌種を共通のプライマーで増幅するsingle allele specific PCRを検討した。この方法は、dex遺伝子塩基配列中の相同性が高くかつ多数の欠損配列が含む部位にプライマーを設定し、同一プライマーでS.mutans(793〜1193領域)とS.sobrinus(1070〜1400)からそれぞれ202bpと226bpを増幅するPCRである。次にマイクロチップ電気泳動の分離能を向上させるために混合ポリマーを検討した。その結果、0.6%HPMCと0.125%PEOの混合からなるポリマー溶液により、226bp(S.mutans)/202bp(S.sobrinus)を分離度2.67で明瞭に分離した。分離時間は約90秒と迅速であった。今回、開発した両測定システムは、齲蝕予防におけるミュータンス連鎖球菌の簡易・迅速かつ高感度検出・同定法として有用な方法と思われる。

研究成果

• [文献書誌] Yoshio Suzuki: "The immunoassay of methotrexate by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection"Analytical Sciences. 19. 2003 (2003)
• [文献書誌] Hidetoshi Arakawa, et al.: "Chemiluminescence assay for catechin based on generation of hydrogen peroxide in basic solution"Analytica Chimica Acta. 472. 75-82 (2002)
• [文献書誌] Hidetoshi Arakawa, et al.: "Detection of two variant Vero toxin genes in Escherichia coli by capillary electrophoresis"Biomedical Chromatography. 16. 41-46 (2002)
• [文献書誌] Hidetoshi Arakawa, et al.: "Single-strand conformation polymorphism analysis of Vitamin D receptor gene Bby capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection"Analytica Chimica Acta. 445. 197-204 (2001)
• [文献書誌] Kazuyuki Watanabe, et al.: "Simultaneous analysis of two-site gene polymorphisms using time-resolved fluorescence immunoassay"Analytical Sciences. 16. 765-769 (2000)
• [文献書誌] Amane Kokado, et al.: "New electrochemical assay of alkaline phosphatase using ascorbic acid 2-phosphate and its application to enzyme immunoassay"Analytica Chimica Acta. 407. 119-125 (2000)