| 研究概要 |
我々は、癌の治療反応性低下すなわち耐性において、分子レベルで機構を解明し、その分子機構を指標とした耐性状態の遺伝子検査法の開発と臨床応用を試みている。昨年度、酸化型葉酸PGAの供給下に作製した5000倍methotrexate(MTX)耐性株化培養白血病細胞CCRF-CEMでは、薬剤膜輸送を担う還元型葉酸キャリア(RFC1)の46番コドンの2番目のヌクレオチド置換によりSer→Asnのアミノ酸置換をもたらすことが判明した。今年度は過剰(1000nM)の還元型葉酸leucovorinの供給下に作製したMTX株化培養白血病細胞CCRF-CEMにおいて、耐性の分子機構を調べた。還元型葉酸leucovorinの供給下に作製したMTX耐性CCRF-CEM細胞をメチルセルロースにてクローン化し、耐性度の異なる3クローン(それぞれ約100,1000,10000倍耐性)を得た。MTX耐性度と耐性の分子機構との関係を調べた結果、DHFRの遺伝子発現は、耐性度に比例して増加が見られ、H^3標識MTXの細胞内取り込みにて評価したMTX膜輸送は、耐性度と反比例して低下が認められた。H^3標識MTXの細胞内保持には有意な差を認めなかった。RFC遺伝子発現には明らかな差を認めず、RFC遺伝子コード領域の塩基配列を検索した結果、47番目コドンのアミノ酸置換をもたらす遺伝子変異が明らかになった。MTX膜輸送低下の分子機構として遺伝子変異により機能低下したRFC遺伝子発現が示唆された。MTX耐性白血病細胞CCRF-CEMにおける耐性の主要な分子機構として、供給される葉酸様式や耐性度によって、DHFR遺伝子発現やRFC1の多様な遺伝子変異が関与していることが明らかとなった。
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