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1方法論の確立
(1)プライマーの取り込み・・・LIPOFECTINとOPTI-MEM(いずれもライフテエク・オリエンタル社製)の組み合わせが最適であり、反応時間は室温30分で十分であった。
(2)テロメレース反応・・・37℃2時間までにテロメレースによる伸長反応はプラトーに達したため、反応時間は2時間とした。
(3)スライドグラスへの貼り付けと固定・・・シランコートのスライドガラスを使用した。
(4)タンパク変性処理・・・37℃15分プロテネース処理と洗浄を行うことで細胞内へのプライマーやポリメレースの浸潤を容易にした。
(5)in situ PCR・・・PCRの反応条件は、94度15秒、53度30秒、72度60秒の27サイクルが最適と思われた。
(6)in situ hybridization・・・テロメア配列(TTAGGG)nに相補的なプローブをビオチンラベルし、96度5分熱変性したPCR産物と42度12時間ハイブリダイゼーションを行なった。
(7)発色反応と形態の同定・・・洗浄後ペルオキシダーゼをラベルしたアビジンと反応させ、発色後ヘマトキシリンで核染色を行なった。
2方法の立証
(1)正常リンパ球はPHA刺激でテロメレース活性が誘導されることがわかっている。この実験系を利用し、正常リンパ球のPHA刺激前後でin situテロメレース活性を測定した。この結果すべてのリンパ球にテロメレース活性が陽性になるわけでは無いことを見い出した。さらに方法論を立証すべく研究を進めている。
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