| 研究概要 |
本研究では、プロテインキナーゼによるリン酸化を特異的に認識する抗リン酸化モチーフ抗体の作製法を開発し、これを用いた簡便なタンパク質のリン酸化の解析法の確立を目的としている。はじめに、脱リン酸化酵素に対して抵抗性であるリン酸化セリン誘導体L-2-amino4-phosphono-4,4-difluorobutanoic acid(F_2Pab)を含むペプチドを抗原として使用するリン酸化モチーフ特異的抗体の作製法を検討した。まず、F_2Pabの大量合成のための条件検討のために小スケールでの合成を実施した。次に、F_2Pab法の有効性を検証するため、癌抑制タンパク質p53に対するリン酸化部位特異的抗体の作製を検討した。p53のSer6またはSer9のリン酸化について、従来のリン酸化ペプチドを抗原として用いる方法では、Ser9の特異的抗体は作製できたが、Ser6部位のリン酸化特異的抗体の生成は確認できなかった。しかし、F_2Pab法を使用したところ、Ser6リン酸化特異的抗体が優先的に生成し、アフィニティ精製によって非常に高力価の特異的抗体を得ることに成功した。この結果は、リン酸化特異的抗体の作製においてF_2Pab法が極めて有効であることを示している。さらに、特定のキナーゼによるリン酸化を認識する抗リン酸化モチーフモノクローナル抗体の作製法を開発した。ATMキナーゼによってリン酸化されるSer(P)-Glnリン酸化モチーフを対象に、このモチーフのみを特異的に認識し、他種のキナーゼによるリン酸化部位とは交叉反応しないモノクローナル抗体の開発に成功した。この過程で、通常の長期間免疫マウスの脾細胞を使用する従来の方法に比べて、短期間免疫マウスのリンパ節細胞を使用する方法が特異的抗体の作製に良好な結果を与えることを見い出した。
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