非ヒストン蛋白質HMGによるヌクレオソーム上での転写制御機構の構造生物学

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12680608
• 研究機関: 北陸先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 楯 真一 北陸先端科学技術大学院大学, 新素材センター, 助教授 (20216998)
• 研究分担者: 島原 秀登 北陸先端科学技術大学院大学, 新素材センター, 助手 (40313704)
• キーワード: NMR / ヌクレオソーム / HMG-14 / 17 / 安定同位体標識 / ヒストン蛋白質

研究概要

1.HMG-14、HMG-17の安定同位体標識試料の大量調製
昨年度構築構築したHMG-14,HMG-17の大量発現系を用いてHMG-14およびHMG-17の安定同位体標識サンプルを調製した。
2.HMG-14とヒストンN末端フラグメントとの相互作用解析
本年度は、以下の実験を行った。1)HMG-14とヒストン蛋白質とが安定な相互作用をするための溶媒条件の検討、2)H3ヒストンおよびH2Bヒストン末端部に相当する20残基程度のペプチドを合成し^<15>N標識したHMG-14との相互作用の解析。1)実験の結果、HMG-14とヒストン蛋白質は、pH8.0以上でのみ十分な親和性で相互作用することがアフィニティーカラムの実験から明らかとなった。この条件でH3ヒストン20残基ペプチドと^<15>N標識したHMG-14との相互作用をNMRにて観測したところ、HMG-14のC末端部のNHシグナルが溶媒との交換に対してプロテクトされることから、HMG-14のC末端部がペプチドと相互作用していることがわかった。また、HMG-14と(H3H4)_4の相互作用では、H3ペプチドとの相互作用時に観測されたのとほぼ同じNHシグナルのみが溶媒との交換に対してプロテクトされ、HMG-14は(H3H4)_4に対してはH3ヒストンの末端部とのみ特異的に結合することがわかった。相互作用様式・結合部位の詳細な解析は、今後進める予定である。
3.再構成ヌクレオソーム調製法の確立
H3,H4,H2A,H2Bの全てのヒストン蛋白質の大腸菌発現系からの調製法を確立した。得られた組換えヒストン蛋白質を用いた、ヌクレオソーム再構成条件の検討を行った。細胞内では独立に挙動する(H3H4)_4および(H2AH2B)複合体形成を別々に検討した。H3,H4は単独でリン酸緩衝液10mMに溶けた状態では巨大な会合体を形成し(H3H4)_4を形成することができなくなるが、リン酸緩衝液添加前にH3とH4を等モル混合すると(H3H4)_4を安定に形成し、会合体形成は生じない。一方H2A,H2Bの場合には単独でリン酸緩衝液に溶けた状態でも会合体を形成することはなく、単に両者が等モル存在するだけで安定な2両体を形成する。DNAを含む完全なヌクレオソーム再構成条件を今後検討する。

研究成果

• [文献書誌] N.Shimba,E.Kariya,S.Tate,H.Kaji,and M.Kainosho: "Structural comparison between wild-type and P25S human cystatin A by NMR spectroscopy. Does thismutation affect the α-helix conformation?,"Journal of structural and functional genomics. 6. 26-42 (2000)
• [文献書誌] N.Tjandra,S.Tate,A.Ono,M.Kainosho,and A.Bax: "The NMR structure of a DNA dodecamer in an aqueous dilute liquid crystalline phase"Journal of American Chemical Society. 122. 6190-6200 (2000)
• [文献書誌] N.Utsunomiya-Tate,K.Kubo,S.Tate,M.Kainosho,E.Katayama,K.Nakajima,and K.Mikoshiba: "Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inihibited by the function-blocking CR-50 antibody"Proc.Natl.Acad.Sci.. 97. 9729-9734 (2000)
• [文献書誌] T.Yoshida,S.Uchiyama,H.Nakano,H.Kashimori,H.Kijima,T.Ohshima,Y.Saihara,T.Ishino,H.Shimahara,T.Yoshida,K.Yokose,T.Ohkubo,A.Kaji and Y.Kobayashi: "Solution Structure of the Ribosome Recycling Factor from Aquifex aeolicus"Biochemistry. (in press). 00-00 (2001)