低分子量G蛋白質Rho-Rho kinaseを介した細胞内情報伝達機構の解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12680648
• 研究機関: 大阪府立成人病センター研究所
• 研究代表者: 伊藤 和幸 大阪府立成人病センター研究所, 部長 (20301806)
• 研究分担者: 吉岡 潔子 大阪府立成人病センター研究所, 主任研究員
• キーワード: Rho / Rho kinase(ROCK) / BMP / 骨形成 / コラーゲン / stromal cell

研究概要

1.動物実験
コラーゲンゲルに含浸させたrecombinant human BMP-2ペレット(3-5μg)をマウス背部筋膜下に移植し、2-3週間後に形成された骨の湿重量、Ca含量計測、X-P撮影を行うと共に、組織標本を作成し顕微鏡観察を行った。Rho-ROCK系の関与を調べる為、同時に浸透圧ポンプを用いてROCK阻害薬(Y-27632)の持続投与を行い、骨形成に対する作用を調べたところ、ROCK阻害薬は濃度依存性に骨形成を約3倍促進した。骨代謝の測定のために、テトラサイクリン2重ラベル法にて宿主の脛骨と、ペレットの骨形態計測を行った結果、ROCK阻害薬は宿主の骨代謝に影響することなくBMP-2により誘導される骨形成を亢進することが明らかとなった。移植したペレットに遊走、浸潤する細胞を詳細に調べたところ、BMP-4(+),osteopontin(+),type1 collagen(+),tartrate resistant acid phosphatase(TRAP)(-)で未分化骨芽細胞系の細胞であることが判明した。
2.培養細胞実験
上記動物実験におけるROCKの骨形成に対する作用機序の解明のために、骨髄由来のstromal cellであるST2細胞にROCK阻害薬を作用させると、BMP-4発現、骨芽細胞の分化マーカーであるAlkaline phosphatase活性、osteocalcinの分泌が濃度依存性に促進された。又分化程度の異なる骨芽細胞系の10T1/2、MC3T3-E1細胞でも同様のROCK阻害薬の骨形成促進効果が観察された。さらにST2細胞に活性型或いはdominant negative formのROCKを遺伝子導入、発現させたところ、ROCKがBMP-4発現、骨形成を負に制御することが明らかとなった。
以上よりROCK阻害薬とコラーゲンゲルBMP-2ペレットを組み合わせることにより、マウス背部に1週間で大腿骨より大きな骨形成が可能となり、臨床応用への道が開けた。

研究成果

• [文献書誌] Nishimura,Y.,Itoh,K.,Yoshioka,K.,Uehata,M.and Himeno M: "Small GTPase Rho/Rho associated kinase as a novel regulator of intracellular redistribution of lysosomes in invasive tumor cells"Cell and Tissue Research. 301. 345-351 (2000)
• [文献書誌] Saeki,Y.,Hazeki,K.,Hazeki,O.,Ui,M.,Itoh,K.,Matsumoto,M.,Toyoshima,K.,Akedo,H.& Seya,Y.: "Participation of a MEK-independent pathway in MAP kinase activation and modulation of cell growth in mouse hepatoma cell lines"Int.J.Mol.Med. 6. 155-160 (2000)
• [文献書誌] Itoh,K.and Yoshioka,K: "Key molecules that regulate breast cancer cells to invade new tissues"ASCB Press Book. 7 (2000)