| 研究概要 |
細胞の増殖・分化を担っているシグナル伝達因子の活性化機構に於いては未だ不明な点も多い。細胞内の何処で、どの様な時間経過でさらにどれ位の数の因子が一度に関与する事が必要とされているのか?また、それらの分子内の構造変化や分子間の会合並びにリン酸化等の修飾による活性化に於いても実時間の刺激に対応する直接的な結果は少ない。活性化機構の1つとして情報伝達蛋白質の2量体化が重要な役割を果たしているらしい。2量体化を可視化するには蛍光エネルギー移動法(FRET)を使う。蛍光標識のためにGFP変異体を融合させ、また、活性化分子の数のオーダーを見積もるために1分子レベルでFRETを直接可視化出来るレーザー顕微鏡の開発も行った。
先ず、蛍光蛋白質によるFRETが蛋白質の2量体化の可視化に利用出来るかを次のモデル系を用いて調べた。大腸菌のDNA gyrase B(GyrB)のN-末サブドメインにGFP変異体を結合させた融合蛋白質を大腸菌で発現、精製した。昨年までにGFP変異体であるCFPとYFPのCoumermycin Aによる2量体化に伴うFRETが溶液系では観察できたが、1分子レベルでの検出には至らなかった。そこで今回、新たにCFPとGFPの間の蛍光波長を生じるGFP変異体(CGFP)を作製し、1分子レベルでのイメージング並びに蛍光特性を調べ、次の結果を得た。
1、CoumermycinによるDNA gyrase B(GyrB)のN-末側分子量24kDaのサブドメインにCGFPとYFPを結合させた融合蛋白質の2量体化に伴う蛍光エネルギー移動は溶液系並びに1分子レベルで可視化する事で観察できた。
一方、紬胞中での情報伝達のやりとりがおこなわれる場所並びに時間経過はこのin vitroでのモデル系実験からでは解らないが、2,生きた細胞を用いて情報伝達物質Raf-1のEGF刺激に対する動態をYFPとのキメラ蛋白(YFP-Raf-1)を用いてイメージングし、EGF刺激後の細胞質から膜に移行する過程を実時間で観察できた。これらの技術を応用し、2量体化と活性化の関係を細胞内で1分子レベルでも計測できるかその可能性を現在検討しており、細胞機能のイメージングヘの応用に繋げたいと考えている。
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