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細胞の増殖・分化を担っているシグナル伝達因子の活性化機構に於いては未だ不明な点も多い。細胞内の何処で、どの様な時間経過でさらにどれ位の数の因子が一度に関与する事が必要とされているのか?また、それらの分子内の構造変化や分子間の会合並びにリン酸化等の修飾による活性化に於いても実時間の刺激に対応する直接的な結果は少ない。活性化機構の1つとして情報伝達蛋白質の2量体化が重要な役割を果たしているらしい。2量体化を可視化するには蛍光エネルギー移動法(FRET)を使う。蛍光標識のためにGFP変異体を融合させ、また、活性化分子の数のオーダーを見積もるために1分子レベルでFRETを直接可視化出来るレーザー顕微鏡の開発も行った。
この2年間の研究成果として、以下の研究成果をあげた。
(1)蛍光蛋白質によるFRETが蛋白分子間相互作用測定法の開発
大腸菌のDNA gyrase B (GyrB)のN-末サブドメインにGFP変異体を結合させた融合蛋白質を大腸菌で発現、精製した。GFP変異体であるCFPとYFPのCoumermycin Aによる2量体化に伴うFRETが溶液系で観察できた。
(2)GFP並びにその変異体の1分子の同定
GFP並びに様々な蛍光特性を有する他の蛍光蛋白質(新たに点変異導入により得られたCGFP等)を1分子レベルでイメージング、さらに、分光出来るレーザー顕微鏡の開発を行い、これらの蛋白質の蛍光特性を1分子レベルでも示し、さらに、CGFPとYFPの2量体化は1分子レベルに於いても可視化できた。
(3)生きた細胞を用いて情報伝達物質Raf-1のEGF刺激に対する動態をYFPとのキメラ蛋白(YFP-Raf-1)を用いてイメージングし、ECF刺激後の細胞質から膜に移行する過程を実時間で観察できた。
以上の様にGFP変異体は1分子レベルでの2量体化観察の分子タグとして有用であることが判明した。これらの技術を応用し、2量体化と活性化の関係を細胞内で1分子レベルでも計測できるかその可能性を現在検討しており、細胞機能のイメージングへの応用に繋げたいと考えている。
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