| 研究概要 |
(1)酸化型チトクロムb561をDEPC(diethyl pyrocarbonate)で処理すると、AsAからの電子伝達が阻害され、ヘムの還元速度が顕著に低下し、しかも約半分のヘムしか還元されない。パルスラジオリシス法によりMDAとの反応を調べると、還元型ヘムの酸化過程は未処理の場合と同程度であったが、続くAsAによるヘムの再還元過程は全く観察されなかった。DEPCによる修飾部位をtrypsin,V8 protease消化断片のMALDI-TOF-MSスペクトルにより解析した結果、His88,His161,Lys85の3つの残基が修飾されていることがわかった。
(2)チトクロムb561をDEPCで処理する際にAsAを添加しておくと、カルベトキシ化による電子伝達反応の阻害から保護されることがわかった。MALDI-TOF-MSスペクトルによる解析の結果、細胞質側ヘムの配位子His88,His161の修飾が阻害され、その結果AsAからの電子受容能が保護されたと考えられる。以上の結果は、チトクロムb561中の2つのヘムは、AsAとMDAとの電子伝達反応において別個の役割を持ち、MDAは小胞内側に位置するヘムを酸化し、その後、細胞質側に位置するヘムからの分子内電子伝達反応が起こると、酸化された細胞質側ヘムが再びAsAにより還元されると思われる。さらに細胞質側ヘムの近傍にAsA結合部位が存在することを示している。
(3)下等な中枢神経系を持つプラナリア(扁形動物門)におけるチトクロムb561の全長のcDNAクローンを得ることに成功した。アミノ酸配列解析により、高等動物で完全に保存されて、機能的に重要な役割を持っていると思われる2つの保存性領域が、プラナリアb561においても完全に保存されていることが明らかとなった。高等動物において完全保存されていた6つのHis残基の内の1つが、Asn残基に置換していることがわかった。この結果、細胞質側のヘムの配位子が特定できた。さらにC末端部位に対する抗体及びcDNAによるin situ hybridizationによりチトクロムb561が神経系特異的に発現していることを明らかにした。
(4)再構成リポソーム膜による解析を行うため、サイズのほぼそろった人工リポソーム中にAsA,cytochrome c等を安定に閉じこめる技術を開発した。さらに、リポソーム膜中に精製したチトクロムb561を埋め込んだリポソームを作製する事に成功し、リポソーム内腔から外部への電子伝達反応を測定する事に成功した。さらに、前もってDEPC処理したチトクロムb561を埋め込むと電子伝達反応が阻害されることもわかった。
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