植物ホルモン(エチレン)センサー蛋白質の構造解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12680666
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 城 宜嗣 理化学研究所, 生体物理化学研究室, 主任研究員 (70183051)
• 研究分担者: 中村 寛夫 理化学研究所, 生体物理化学研究室, 先任研究員 (80270594) ; 朴 三用 理化学研究所, 研究技術開発室, 研究員 (20291932)
• キーワード: 植物ホルモン / エチレン / ヒスチジンキナーゼ / 二成分系 / 銅

研究概要

植物ホルモンであるエチレンの受容体(エチレンセンサー蛋白質ETR1)のセンサー部位を大腸菌で発現させる系を構築し、その組換え蛋白質の精製条件を検討した。発現蛋白質を陰イオン交換カラム、Ni-NTAカラム(C末にHis-Tagを付けてある)、さらにアミロース担持樹脂カラムで精製し、SDS-PAGEでほぼ80%程度の純度の試料(0.1mM,0.3ml)を得た。この組換ETR1はN末端に膜透過性蛋白質(マルトース結合蛋白質MalE)を融合しており、アミノ酸分析によりN末端アミノ酸残基を決定し、組換ETR1は天然型同様に膜貫通型でフォールドしいる事を確認した。しかし、ICP分光分析により、活性点に存在すべき銅が結合していない事がわかったので、蛋白質溶液に銅を添加した後に再度精製した。SPring-8およびPFにおいてX線吸収スペクトル(XANES)を測定し、その結果をモデル錯体の測定結果と比較したところ、銅はETR1に結合しているものの銅二価の状態であり、この状態ではエチレンは結合しない事が明らかとなった。現在、銅添加後にETR1を還元雰囲気下におき、銅一価の状態でのXANES測定を行うべく試料を準備中である。
上記XANES測定と平行して、組換ETR1(MalE融合型)の結晶化条件の検索をおこなった。しかし、80%程度の純度では単結晶は得られなかった。90%以上の純度の結晶化用試料を得るための、精製条件を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Shimizu,H.,Obayashi,E.,Gomi,Y.,Arakawa,H.,Park,S.-Y., et al.: "Proton Delivery in NO Reduction by Fungal Nitric Oxide Reductase : Cryogenic-crsyatllography, Spectroscopy and Kinetics of Ferric-NO Complexes of Wild-Type……"J.Biol.Chem.. 275. 4816-4826 (2000)
• [文献書誌] Shimizu,H.,S.-Y.Park,D.-S.Lee,Shoun,H.,Shiro,Y.: "Crystal Structures of Cytochrome P450 nor and Its Mutants (Σερ286→Val,Thr) in the Ferric Resting State at Cryogenic Temperature : A Comparative Analysis with……"J.Inorg.Biochem.. 81. 191-205 (2000)
• [文献書誌] Miyatake,H.,Mukai,M.,Park,S-Y.,Adachi,S.,Tamura,K., et al: "Sensory Mechanism of Oxygen Sensor FixL from Rhizobium meliloti : Crystallographic Mutagenesis and Resonance Raman Spectroscopic Studies"J.Mol.Biol.. 301. 415-431 (2000)
• [文献書誌] Park,S.-Y.,Yamane,K.,Adachi,S.,Shiro,Y.,Weiss,K.E.,Sligar,S.G.: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Analysis of Cytochrome P450 (CYP119) from Sulfolobus solfataricus"Acta Crystall.. D56. 1173-1175 (2000)
• [文献書誌] Sun,D.,Sato,M.,Yoshida,T.,Shimizu,H.,Miyatake,H.,Adachi,S., et al.: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Analysis of a Rat Biliverdine Reductase"Acta Crystall.. D56. 1180-1182 (2000)
• [文献書誌] Mukai,M.,Nakamura,K.,Nakamura,H.,Iizuka,T.,Shiro,Y.: "Role of Ile209 and Ile210 on the Heme Pocket Structure and Regulation of Histidine Kinase Activity of Oxygen Sensor FixL from Rhizobium meliloti"Biochemistry. 39. 13810-13816 (2000)