大腸菌染色体複製サイクルの制御マシナリー

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12680677
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 片山 勉 九州大学, 薬学研究院, 助教授 (70264059)
• キーワード: DNA複製 / 細胞周期 / DNAポリメラーゼ / DnaAタンパク質 / ATP / AAA+ファミリー / 染色体複製開始制御 / 大腸菌

研究概要

大腸菌ではATP結合型DnaA蛋白質が複製開始DNA領域と結合し開始複合体を形成する。申請者らは、複製開始反応後、DNAポリメラーゼIII(大腸菌の染色体レプリカーゼ)がDNA上にロードされて形成される複合体(スライディングクランプ)によって、DnaA蛋白質のATPが加水分解され、複製能がないADP結合型へ変換されることを見出した(Cell,1998)。この機構をDnaA蛋白質の制御的不活性化と(RIDA)命名した。この機構は過剰な複製開始を防止する。申請者らはin vivoにおいても複製開始前にはATP結合型DnaA蛋白質が蓄積し、複製開始後速やかにADP型へと変換して行くことを明らかにした(EMBO J.,1999)。第1の目的である、DnaA蛋白質の不活性化の分子機構・DNA複製との共役機構の解明、に関しては、RIDAに必要な因子(IdaB/Hda蛋白質・遺伝子)を同定し、精製した蛋白質のみを用いてin vitro再構成系の構築にも成功した。(EMBO J.,2001)。この系を用いて、RIDA機構におけるHda蛋白質の機能を解析した(学会等で発表済み)。さらに、RIDA反応に必要なDnaA蛋白質のアミノ酸残基の同定も行い(Mol. Microbiol.,2001)、RIDAの複製制御におけ必須な機能を事付けた(J.B.C.,2002)。加えて、DnaA蛋白質の細胞周期依存的活性化の分子機構の解明のため、ADP型DnaA蛋白質を再活性化する因子の探索を行い、ある特定のDNA存在下で機能する蛋白性因子の存在が強く示唆された(学会発表済み)。そのような機能DNA断片をDARSと名付け、最小領域の決定・機能単位の同定を行った(学会発表済み)。以上のように、本計画研究では、DnaAの抑制システム(RIDA)の分子機構解明と複製開始の活性化因子の探索という2つの課題に対し充分な進展が得られた。

研究成果

• [文献書誌] Nishida, S., Fujimitsu, K., Sekimizu, K., Ohmura, T., Ueda, T., Katayama, T.: "A nucleotide switch in E. coli DnaA protein initiates the chromosomal replication : Evidence from a mutant DnaA protein defective in regulatory ATP hydrolysis in vitro and in vivo"Journal of Biological Chemistry. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] Onogi, T., Ohsumi, K., Katayama, T., Hiraga, S.: "Replication-dependent recruitment of the β subunit of DNA polymerase III from cytsolic spaces to replication forks in Escherichia coli"Journal of Bacteriology. 183・4. 867-870 (2002)
• [文献書誌] Kubota, T., Ito, Y., Sekimizu, K., Tagaya, M., Katayama, T.: "DnaA protein Lys-415 is close to the ATP-binding site : ATP-pyridoxal affinity labeling"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 288・5. 1141-1148 (2001)
• [文献書誌] Kawakami, H., Iwura, T., Takata, M., Sekimizu, K., Hiraga, S., Katayama, T.: "Arrest of cell division and nucleoid partition by genetic alterations in the sliding clamp of the replicase and DnaA protein"Mol. Genet. Genomics. 266. 167-179 (2001)
• [文献書誌] Kato, J., Katayama, T.: "Hda, a novel DnaA-related Protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli"EMBO Journal. 20・15. 4253-4262 (2001)
• [文献書誌] Su'etsugu, M., Kawakami, H., Kurokawa, K., Kubota, T., Takata, M., Katayama, T.: "DNA replication-coupled inactivation of DnaA protein in vitro : a role for DnaA arginine-334 of the AAA^+ Box VIII motif in ATP hydrolysis"Molecular Microbiology. 40・2. 376-386 (2001)