平滑筋細胞内でのミオシン線維安定化因子の機能解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12680691
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 岡垣 壮 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (80185412)
• 研究分担者: 小浜 一弘 群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)
• キーワード: 血管 / 平滑筋 / ミオシン / ミオシン線維

研究概要

ニワトリ平滑筋から単離したミオシン線維を安定化する因子38k蛋白質のアミノ酸配列から、この蛋白質はヒトp32のホモログであると考えられる。ヒトp32はミトコンドリアにおいても機能することが知られていて、N端から72アミノ酸残基がミトコンドリア内膜への取込みのシグナル配列として機能している。我々は平滑筋が形質変換すると、細胞内でのp32の分布が細胞質から核へと変化することを見い出した。細胞内でp32が移動するときにシグナル配列がどのような機能をしているのかを明らかにし、平滑筋の形質変換におけるp32の役割を解明することを目標のひとつとしている。平成12年度にはニワトリ砂嚢のmRNAからcDNAライブラリーを作製して、ニワトリp32の全長のcDNAを得ようと努力したが、目標を達成できなかった。その原因としてシグナル配列が極めてGC-richのためにシグナル配列の部分をコードするcDNAの合成が困難であることがわかった。そこで平成13年度ではHeLa細胞よりヒトp32の全長をコードするcDNAを単離することを試みた。市販のHeLa細胞のcDNAライブラリーを3種類購入し、さらに共同研究者から1種類のライブラリーを得て抗体によるスクリーニングをした。しかしいずれのライブラリーにもp32の全長をコードするクローンは含まれていなかった。最も長いクローンでも全長より約60bp短い配列であることがわかった。そこでHeLa細胞を培養してmRNAを単離し、RT-PCRによってヒトp32の全長のcDNAを合成することにした。この際GC-richな配列のcDNAの合成をするために、高温(50-60℃)でも機能する逆転写酵素を使用することにした。最近になってようやく850bpのp32の全長のcDNAが得られるようになった。現在これをもとにシグナル配列を大腸菌で発現しシグナル配列を認識する抗体を作製する準備をおこなっている。さらにシグナル配列を変異化させたp32の配列をp3FFLAG-CMV7.1にサブクローニングする。これを平滑筋細胞内に遺伝子導入し、その挙動をFLAG抗体を使って調べる実験が進行中である。またシグナル配列をもつp32と、その部分を欠失しているp32とを大腸菌で発現し、ミオシンとの結合性を比較する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Gao, Ye, Kishi, Okagaki, Samizo, Nakamura, Kohama: "Myosin light chain kinase as a multifunctional regulatory protein of smooth muscle contraction"IUBMB Life. 51. 337-344 (2001)
• [文献書誌] Tsutsumi, 5 persons, Kohama: "Propofol activates vanilloid receptor channels expressed in human embryonic kidney 293 cells"Neurosci.Lett.. 312. 45-49 (2001)
• [文献書誌] Samizo, Ishikawa, Nakamura, Kohama: "A highly sensitive method for measurement of myosin ATPase activity by reversed-phase high-performance liquid chromatography"Anal.Biochem.. 293. 212-215 (2001)
• [文献書誌] Okagaki, 5 persons: "Comparison of mechanochemical properties of myosin from carp ordinary and dark muscles"Fishery Science. 68(in press). (2002)