GFPタグミオシンを発現している細胞性粘菌の細胞に局所的にレーザー照射して退色、その後の蛍光の回復を高感度デジタルカメラによりモニターし、継時的に定量化する。単量体と繊維ではその拡散定数が異なるため区別できる。また、細胞骨格に組み込まれたミオシンとそうでないものもこの方法により区別できる。この方法により、照射した局所領域での単量体と繊維の存在比、単量体と繊維の交換速度など分子平衡の速度論的性質について明らかにしつつある。さらに、動的な平衡が生じている細胞内領域の特定に関しては、細胞表層であることが明らかになった。ミオシン重鎖キナーゼAの抗体による蛍光抗体法やGFPタグ法により、その分布は表層であること、また、仮足などに多いことが分かった。 ミオシンの繊維調節に関わるドメインを改変したミオシン遺伝子にGFPタグを付け、ミオシン欠損細胞に発現させ、FRAPを行った結果、ミオシン重鎖のリン酸化部位が動的平衡に重要であることがわかった。 CAU法については、現在、in vitroでの条件を検討中である。
|