ステロイドホルモンレセプターの神経系細胞内における動態の解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12680735
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 西 真弓 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (40295639)
• 研究分担者: 松田 賢一 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (40315932) ; 小澤 一史 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (60169290)
• キーワード: リアルタイムイメージング / 蛋白一蛋白相互作用 / ステロイドホルモンレセプター / 核-細胞質間輸送 / GFP / 生細胞 / FRET / 初代培養神経細胞

研究概要

申請者らはGFPとの融合により、ステロイドホルモンレセプターの生細胞内における局在をリアルタイムで解析する実験系を確立し、研究を進めてきた。GFPおよびそのspectral variantであるCFP、YFPなどと種々のステロイドホルモンレセプター(本研究課題においては主としてグルココルチコイドレセプター(GR)、ミネラルコルチコイドレセプター(MR))あるいは核-細胞質間輸送蛋白のimportinαやimportinβとのキメラ遺伝子を作成した。これらをCV-1,COS-1細胞、初代海馬培養神経細胞、初代培養グリア細胞などにリポフェション法によりトランスフェクションし、レセプターや共役転写因子がリガンドの添加や細胞外環境の変化に対してどのような挙動を示すのかを、落射型蛍光顕微鏡と冷却CCDカメラの組合せまたは共焦点レーザー顕微鏡を用い、リアルタイムに追跡した。その結果、GRはリガンドの非存在下では主として細胞質に局在し、MRは細胞質と核の両者に分布することが認められ、リガンドの添加によりGRおよびMRともに速やかに核内へ移行することが、また核内移行に際して微小管などの関与は認められないことなどが明らかにされた。さらに、GRおよびMRを各々CFPおよびYFPで二重標識して同一細胞内に共発現させた実験において、核内移行速度は内因性のレセプターをもたないCOS細胞ではリガンドに対する親和性の差を反映していたが、内因性のGRおよびMRが共発現する海馬の神経細胞ではリガンドに対する親和性を反映した核移行速度の差は認められず、異なる核輸送の機構が存在する可能性が示唆された。また、hsp90の特異的阻害剤であるgeldanamycin投与によりCOS細胞においてGRおよびMRの核移行が阻害され、これらレセプターの核移行にhsp90が重要な役割を担っていることが示唆された。さらにGRやMRの核移行シグナル(NLS)を認識するimportinαをCOS細胞に発現させると、細胞質、核の両方に存在する細胞が多く認められたが、細胞質有意、核有意に存在するものも認めた。外からの刺激なしでも核内への移行が観察されたが、GRやMRと共発現させた場合は、リガンドの添加によって細胞質に存在するimportinαの核内への強い集積を認め、輸送蛋白が核内レセプターとともに動く像をリアルタイムに可視化し、捉えることができた。今後は、FRETなどの手法を加えて、時空間特異的にこれらレセプターと輸送蛋白との相互作用を追跡していきたいと考えている。

研究成果

• [文献書誌] Nishi M: "Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons"Brain Res.. 868. 113-118 (2000)
• [文献書誌] Ito T.: "In vitro and in vivo immunohistochemistry for the distribution of mineralocorticoid receptor with specific antibody"Neurosci Res. 37. 173-182 (2000)
• [文献書誌] Yoshimoto K.: "Changes in dopamine transporter and c-Fos expression in the nucleus accumbens of alcohol-tolerant rats"Alcohol Clin Exp Res. 24. 361-365 (2000)
• [文献書誌] Maegawa Y.: "Effects of near-infrared low level laser irradiation on microcirculation"Lasers in Surgery and Medicine. 27. 427-437 (2000)
• [文献書誌] Ogawa H.: "Localization of nuclear coactivators p300 and steroid receptor coactivator 1 in the rat hippocampus"Brain Res. 890. 197-202 (2001)
• [文献書誌] Nishi M.: "Dynamic changes in subcellular localization of mineralocorticoid receptor in living cells : Incomparison with glucocorticoid receptor using dual-color labeling with green fluorescent protein spectral variants."Mol Endocrinol. 15. 1077-1092 (2001)
• [文献書誌] Lu H: "Serotonergic neurons in dorsal raphe nucleus that project into the medial Preoptic area contain estrogen receptor β"J Neuroendocrinol. 13. 839-845 (2001)
• [文献書誌] Nishi M: "Motoneuron-specific expression of NR3B, a novel NMDA-type glutamate receptor subunit that works in a dominant-negative manner"J Neurosci. 21. RC185 (2001)
• [文献書誌] Yoshida M: "Subcellular and subnuclear distributions of estrogen receptor α in living cells using green fluorescent protein"Acta Histochem Cytochem. 34. 413-422 (2001)
• [文献書誌] Kawata M: "Intracellular dynamics of steroid hormone receptor"Neurosci Res. 40. 197-203 (2001)
• [文献書誌] 河田 光博: "転写因子としてのステロイドホルモンレセプターの細胞内動態とその生理的意味"自律神経. 37. 215-220 (2000)
• [文献書誌] 西 真弓: "コルチコステロイドレセプターとストレス"日本神経精神薬理. 20. 181-188 (2000)
• [文献書誌] Kawata M.: "Neuroplasticity, Development, and Steroid Hormone Action"CRC Prress LLC. 405 (2001)