| 研究概要 |
1 Tet-regulated systemを用いたPKC-GFP融合蛋白質トランスジェニックマウスの作製と解析
(1)脳部位特異的にtetracycline transactivator (tTA)を発現させるマウスの作製
neuron specific enolase promoterの下流にtTAを発現するマウス(NSE-tTA)、calcium calmodulin kinaseII promoterの支配下にtTAを発現するマウス(CamKII-tTA)の発現部位の特徴ににつき解析した。NSE-tTAマウスは、線条体、小脳特異的にtTAを発現誘導させることを確認した。新しく、γPKC promoterの支配下にtTAを発現させるマウス(PKCγ-tTA)とL7/pcp promoterの支配下にtTAを発現させるマウス(L7-tTA)を作製した。現在tTAが目的部位に特異的に発現誘導されるかを検討している。
(2)Tetracycline operated promoter (TetOp promoter)の支配下に目的のPKC-GFP融合蛋白質を発現させるトランスジェニックマウスの作製
本研究で新たに、PKCγ PKCε PKCδ,PKCζ分子種にGFPを融合させた蛋白質を発現させるトランスジェニックマウス(TetOp-PKCγ-GFPマウス,TetOp-PKCε-GFPマウス、TetOp-PKCδ-GFPマウスTptOp-PKCζ-GFPマウス)を作製した。
(3)(1)(2)のマウスを交配させPKC-GFP融合蛋白質を脳部位特異的に発現させるトランスジェニックマウスの作製
TetOp-PKCγ-GFPマウスあるいはTetOp-PKCε-GFPマウスをNSE-tTAマウスと交配させると線条体、小脳プルキンエ細胞にPKC-GFPが発現することを確認した。また、CamKII-tTAマウスと交配させると海馬を含む前脳全体にPKC-GFPが発現した。これらの目的蛋白発現は、doxycyclineにより発現のon ofが可能であることを確認した。
2 PKC-GFP融合蛋白質発現マウスの解析
PKCγ-GFP発現マウスから小脳スライスを作製し、2光子励起レーザー顕微鏡を用いてPKCのトランスロケーションを観察したプルキンエ細胞において、グルタミン酸受容体を刺激することで、実際にPKCがトランスロケーションすることが確認された。
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