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1、ヒメツリガネゴケ完全長cDNAライブラリーの作成とその過剰発現
(1)ヒメツリガネゴケの原糸体から、オリゴキャップ法に基づき完全長cDNAライブラリーを作成した。同様に、サイトカイニン処理あるいは、オ-キシン処理した組織由来の完全長cDNAライブラリーもまもなく完成する。最初に作成した完全長cDNAライブラリーの各クローンの5'末端、3'末端からそれぞれ塩基配列を決定した。その結果、約90%以上のクローンが完全長であり、良質のライブラリーであると推定できた。来年度にかけて、2万クローンの5'側塩基配列を決定する予定である。
(2)完全長cDNAをヒメツリガネゴケのターゲットサイトに相同組換えを利用して導入し、過剰発現させるためのベクターを作成した。この過剰発現ベクターが正しくコケのなかで働くことを確かめる目的で、アグロバクテリウム由来のサイトカイニン合成酵素(ipt)遺伝子を今回作成したベクターにサブクローニングし、コケに導入した。その結果、原糸体の分枝異常や、葉の形態異常を示す形質転換体が複数ライン得られ、導入した遺伝子の過剰発現システムがうまく機能したと考えられた。
(3)塩基配列を決定した完全長cDNAクローンを今回開発したシステムを用いてコケに順次導入を開始した。既存のタグラインからの遺伝子の単離は、タグが、多くの場合でマルチコピーで導入されており、現状では、単純ではないことが分かった。従って、来年度は、より多くの過剰発現変異体を作成し、形態変化、サイトカイニン応答に異常の見られる突然変異体の大規模スクリーニングをすすめて行く。この方法では、タグラインからのスクリーニングと異なり、変異体単離と同時に原因遺伝子を手にしていることになる。従って、得られた遺伝子の機能は、即座にシロイヌナズナに導入し、既存のサイトカイニン関連の変異体との関連を推定することができる。
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