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昨年度の研究では大腸菌ヌクレアーゼEcoRIをモデルタンパク質とし、酵母Pichia pastorisを宿主としたヌクレアーゼ生産系の開発を行った。今年度、EcoRIを細胞内生産を検討した。その結果、過剰生産されたEcoRIが酵母の核膜内に存在する核を消化することによる細胞増殖阻害が見られた。その回避を目的として、細胞小器官(具体的にはペルオキシソーム)への輸送シグナル配列を遺伝子工学的手法により付与したEcoRI・SKL遺伝子を新規に構築し酵母内での発現に成功した。蛍光顕微鏡により輸送シグナル配列の存在により標識タンパク質が正しくペルオキシソームに移送されていることが明らかとなった。また、本年度において他研究施設から入手したヒトDNaseIを有する発現ブラスミドを新規に作成し、酵母Pichia pastorisヒスチジン要求株に導入した。その結果として、活性をもつヒトDNaseIを生産するに至らなかった。これは酵母が、活性をもたない、あるいは非常に低い活性しか持たないヒトDNaseIをのみ、生産したためと考えられる。現在、糖鎖修飾による異常タンパク質の可能性、あるいはDNaseIの分泌異常の可能性を検討している。その様な場合には、大腸菌を宿主とした遺伝子変異操作を実施する必要がでてくる。この様な手順を踏み、首尾良く高い活性を有するヒトDNaseIを生産できた場合、どこにその要因があるのか、タンパク構造から検討をする必要がある。
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