| 研究概要 |
(1)部分欠失サブユニットの取得;麹菌Hap複合体のサブユニット遺伝子AohapB,AohapC,AohapEを出発材料として、それぞれ部分欠失変異を作製した。これら部分欠失サブユニットとGST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)との融合蛋白質を大腸菌において発現させた。
(2)部分欠失サブユニットのin vitro解析;GST融合蛋白質をグルタチオン固定化樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製を行った。3つのサブユニットについて、それぞれ部分欠失サブユニットと全長サブユニットの組合わせでCCAAT結合複合体の再構成を行い、DNA結合に関して解析を行なった。その結果、いずれのサブユニットに関しても、少なくともコア領域(真核生物間で高度に保存されている領域)さえあれば、CCAAT配列に特異的に結合できることが示された。
(3)核画分のフラクショネーション法の確立;AnCPのサブユニットの核への局在化能を評価するために、糸状菌から核を単離する方法を改良して、菌糸破砕試料より核画分を迅速に分画できるフラクショネーション法を確立した。野性株に加え、AohapB,AohapC,AohapE欠失株より調製した試料を抗HapB,HapC,HapE抗体でイムノブロット解析することにより、それぞれのサブユニットの核への局在化を解析した。その結果、野性株および全ての欠失株において全てのサブユニットが核画分から検出され、複合体の形成とは関係なくサブユニットの核移行が行われていることが明かとなった。
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