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好アルカリ性Bacillus pseudofirmus OF4(Bacillus firmusから学術名称を変更)の新規複合体型Na^+/H^+アンチポーターMrpの生理的機能を明らかにするため、平成12年度は、以下のような実験を行ない、有用な結果を得た。
まず、mrpオペロンをコードしているDNA断片を含むプラスミド(pMWmrp1)を大腸菌や枯草菌のNa^+/H^+アンチポーター欠損変異株や呼吸鎖末端酵素欠損株に形質転換した。pMWmrp1を保持するNa^+/H^+アンチポーター欠損変異株は、いずれの場合も欠損を相補した。pMWmrp1を保持する呼吸鎖末端酵素欠損株は、膜電位の乏しい環境でも十分なNa^+耐性を持つことから、Mrpが膜電位に依存した二次輸送系としてばかりではなく、酸化還元電位を利用した一次輸送系としても機能しうることが示唆された。これについては、今後、更なる実験系の考案を検討中である。
次に、OF4株染色体上のmrpオペロンの一部もしくはすべてを欠損した株を取得しようと試みたが、成功しなかった。この理由として、このような変異がOF4株に致死的な変異であり、mrpオペロンにコードされた全ての遺伝子が完全な機能するために必須であることが示唆された。欠損変異株を用いた研究は、Mrpの機能解析に不可欠であるため、染色体上のmrpプロモーター領域をIPTGで遺伝子の発現を誘導できるP_<spac>プロモーターに置換した変異株を現在、作製中である。変異株を取得後、機能解析を行う予定でいる。
また、Na^+/H^+アンチポーター機能の中心的役割を担っていると考えられるMrpAとMrpDのC-末端側にHis_6タグを付けた融合タンパク質発現ベクターを構築した。これにより、来年度のMrp複合体の精製を行うための予備検討を行っているところである。
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