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本年度は、シタロン脱水酵素(STD)のC末を中心としたアミノ酸の基質結合における関与を解析するために変異酵素を作成し、酵素キネティクスとX線結晶構造解析により機能解析を行った。
(1)STDと競争阻害剤との複合体の三次元構造情報をもとに、基質結合に関与することが推定されるC末領域を中心とするアミノ酸の変異酵素(Y50A、F53A、V75A、F156A、F158A、F162A、F169A)cDNAを部位指定変異導入法により作成し、大腸菌で大量発現させ、各変異酵素を精製した。
(2)得られた組換えSTDを酵素キネティクスにより解析した。ここで、触媒効率と基質との親和性が共に低下することを基質結合に関与することの指標にした。このような解析により、基質の結合に重要な影響を与える変異を検索した。全ての変異酵素で触媒効率と基質との親和性が共に低下する現象が認められた。特にF158AやF162Aでこのような傾向が顕著に認められ、更に興味深いことに、これら二種の変異酵素はアロステリック酵素として振る舞うことがあり、これらの変異が基質の結合に影響を与えることが示唆された。この結果からC末領域が基質結合に関与する可能性が示された。
(3)更にその変異酵素のひとつF162Aの構造をX線結晶構造解析により明らかにした。F162Aは変異により基本的な全体構造を変化させることなく、基質との親和性を低下させていることが明らかとなった。
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