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DHPRα1s欠損GLT細胞株(dysgenic mouse骨格筋由来細胞株)において、相同組換えとリガンド依存性Creリコンビナーゼによる部位特異的遺伝子組換えを併用した遺伝子ノックアウト法を用い、内在性マウスRyR遺伝子をノックアウトしてカエルのDHPRα1sとα-RyRまたはβ-RyRを発現できる系の作製を計画した。
発現ベクターの作成・・・断片化されたままのDHPRα1sサブユニット約7kbを発現ベクターのpCI neoに構築した。αとβの2種類のRyR、それぞれ全長約15kbをpcDNA3.1/Hygに構築した。各クローンの5'末端は開始メチオニンの上流にコザック配列を組み込み、その上流に発現ベクターに挿入できるサイトを作製した。ライブラリースクリーニングから得られた断片クローンにはオーバーラップの領域が短く、直接は結合が不可能な箇所がいくつかあった。その点に関してはオーバーラップ領域をPCRで再クローニングし、シークエンスをして配列を確認して構築に用いた。構築する際に不都合になる内在性制限酵素サイトはあらかじめアミノ酸配列に変化を起こさないよう塩基配列に変異を入れて用いた。
培養細胞の準備・・・GLT細胞株の入手に関しては、その樹立者のDr.Powelに交渉中である。
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