| 研究概要 |
1.ATCCより購入したphagemid(No.80050)を制限酵素NheIで消化し、ヒトPKC epsilon full length cDNA断片をゲル濾過により採取した。さらにT4 DNA polymeraseによりblunt end末端を作成した。
2.1.で作成したcDNAをPaxCAwt2 Cosmid Vector(Adenovirus Expression Vector Kit、Takara)のSwaI制限酵素部位にblunt end ligationを行い挿入した。さらにDNA-TPCとともに293cellにリンサンカルシウム法でco-transfectionした。相同組換えにより得られたウィルスCVLの上滑を再度293cellに感染させウエスタンブロットによりPKC epsilon蛋白の発現を確認した。プラーク法により単一ウィルスを採取し、再度293細胞に感染後、ウエスタンブロットによりPKC epsilonの発現を確認した。さらに293 cellで増幅後、プラーク法によりウィルス力化を測定した(2x10^9pfu/ml)。
3.口腔癌樹立細胞株(SCC4,SCC15,IMC-2,SCCKN,SCCTF)に1-100pfu/cellで感染後発現蛋白が感染量に依存し、かつ経時的に増加することを確認した。コントロールとしてNIHで作成したAdCMVβーgalと理化学研究所より購入したAxCALacZ recombinant adenovirus(斉藤泉博士作成)を使用した。
4.現在感染後のPMA刺激をしてERKs,MKPなどの細胞内伝達因子の発現について検索中である。
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