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我々が樹立したモノクローナル抗体に反応し、腎病変局所に局在する分子の遺伝子を単離するにあたり、以下の2つの作業仮説をたてた。
作業仮説1、目的とする分子は、患者染色体DNA上に存在する遺伝子によってコードされる。
作業仮説2、モノクローナル抗体が交差反応することから、目的とする分子は、この抗体に反応することが判っているレトロウイルス構成分子とアミノ酸レベル・塩基レベルでの相同性が高い。
上述の作業仮説に従い、まず抗体が認識するエピトープを含むレトロウイルス遺伝子断片をプローブとしてGenomic Southern Blottingを行い、プローブと相同性の高い塩基配列が患者染色体DNA上に存在することの確認を試みた。ハイブリダイゼーション反応は、塩濃度5×SSPE、温度55度(ホルムアミド非存在下)で行った。洗いは、2×SSC-0.1%SDSを用いて55度20分/60度20分/69度20分各一回行った。その結果、確かにプローブと高い相同性を有する塩基配列が存在することが判明した。この塩基配列は、全染色体DNA上に少なくとも5コピー存在し、患者のみでなく、健常人(日本人男女、白人男性)の染色体DNA上にも存在していた。患者染色体DNA、健常人染色体DNAの間で、明確なRFLPは認められなかった。現在、この塩基配列を含む遺伝子断片を単離するべく、Genomic Libraryの構築を行っている。
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