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1.ターゲッティングベクターの作製
マウスDRPLAcDNAのexon2からexon5を含む1.3kb.の断片をプローブとして、マウス129Svゲノムライブラリーの1.1X10^6の組み換体をスクリーニングした。最終的に17個の独立したクローンを得た。詳細な制限酵素地図を作製した後、ターゲッティングベクターを構築した。5側相同領域は2.4kb.で3側の相同領域は7.1kb.とし、クローン選択の際の薬剤耐性遺伝子としてneomycin耐性遺伝子をphosphoglycerol kinase(PGK)promotorの制御下に発現するように組み込んだ。また相同組換個体において遺伝子発現の時間的空間的発現を検索する目的で、レポーター遺伝子としてexon2にin frameになるようにβ galactosidase遺伝子を挿入した。またnegative selectionの目的で5側にDTAを挿入した。最終的には全長19kb.のターゲッティングベクターを構築した。
2.ジーンタッゲティング
ES細胞株はCCEを用いた。2.3X10^7個のES細胞に対して線状化したターゲッティングベクター50ugを用い、270V、500uF、720オームでエレクトロポレーションした。その後ネオマイシンによる薬剤選択を行い、最終的に120個の耐性クローンを得た。この陽性クローンについてターゲッティングベクターの外側に置いた5側及び3側のプローブを用いてサザン解析を行い、最終的に相同組み換え体を12クローン得た。
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