カルシウム感知受容体の構造活性相関の解析とそのカルシウム代謝調節異常症への応用.

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12770627
• 研究機関: (財)生産開発科学研究所
• 研究代表者: 小松 弥郷 財団法人生産開発科学研究所, 成人病科学研究室, 研究員 (40322648)
• 研究分担者: 須田 道雄 財団法人生産開発科学研究所, 成人病科学研究室, 研究員 (40301741)
• キーワード: カルシウム感知受容体 / 抗体 / 細胞外ドメイン / 一過性過剰発現細胞 / 高カルシウム血症 / 低カルシウム血症

研究概要

ヒトカルシウム感知受容体の細胞外ドメインから選択した部位に相当する7種類のペプチド(CASR1-7)を固層法により合成し、HPLCにより精製し、合成ペプチドを得た。CASR1;YPESKENKDVPTGSRRRGRPC,CASR2;ESDLGWTLASTSGLRLELEAY,CASR3;EML-DVPTGSRRRGRPC,CASR4;CWDLSSGHKKWIIOVPI,CASR5;CEVSGTLWQIQMHY,CASR6;CEVQAEURJSWSRWTLA,CASR7;CALDFKRKARSGSSSYSYGAM.これらをそれぞれ3種類のマウスに免疫し、それぞれのペプチドに対する抗血清を得た。抗原ペプチド(CASR1-7)を用いたドットブロット法によりそれぞれの血清の抗体価を評価した。いずれの血清も抗原を認識したが、なかでもN端細胞外ドメイン由来であるCASR2,CASR3で免疫した血清は強い活性を示した。そこで、最も強い活性を示した抗CASR2a抗体,抗CASR3b抗体を用いて実際のヒトカルシウム感知受容体を認識するか検討した。発現プラスミドであるpcDNA.CASRを陽イオンリポゾーム法にてCOS細胞にtransfectionし、一過性にヒトカルシウム感知受容体を過剰発現させ、この細胞から抽出したタンパクをSDS-PAGEにて泳動し、ウエスタンブロット法にて検討したところ、ヒトカルシウム感知受容体に対応する約80kDのバンドを特異的に検出した。また、site-directed mutagenesis法にてヒトカルシウム感知受容体の細胞外ドメインを一部欠失したmutant受容体を作成し同様の検討を行ったところ、欠失部位を認識する抗CASR2a抗体は受容体を認識しなかったが、抗CASR3b抗体では約65kDのmutant受容体を検出した。

研究成果

• [文献書誌] Chusho,H.,Ogawa,Y.,Tamura,N.,Suda,M.,Yasoda,A.,Miyazawa,T.,Kishimoto,I.,Komatsu,Y., et. al.,: "Genetic models reveal that brain natriuretic peptide can signal through different tissue-specific receptor mediated pathways."Endocrinology. 141. 3807-3813 (2000)
• [文献書誌] Sakuma,Y.,Tanaka,K.,Suda,M.,Komatsu,Y., et. al.,: "Impaired bone resorption by lipopolysaccaride in vivo mice deficient in the prostaglandin E receptor EP4 subtype."Infection and Immunity. 68. 6819-6825 (2000)
• [文献書誌] Takaya,K.,Ariyasu,H.,Kanamoto,N.,Iwakura,H.,Yoshimoto,A.,Harada,M.,Mori,K.,Komatsu,Y., et. al.,: "Ghrelin strongly stimulates growth hormone (GH) release in humans."J.Clin.Endocrinol.Metab. 85. 4908-4911 (2000)
• [文献書誌] 小松弥郷: "スタチンと骨そしょう症"最新医学. 55. 2231-2239 (2000)
• [文献書誌] 中所英樹,小川佳宏,宮澤崇,小松弥郷,中尾一和: "BNPトランスジェニックマワスの骨病変"Clincal Calcium. 10. 1249-1251 (2000)
• [文献書誌] 小松弥郷: "HMG CoAリダクターゼ阻害剤(スタチン)の骨形成促進作用"The Bone. 55(印刷中). (2001)