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1)試料調製法改良による夾雑成分の除去
マウス松果体について試料調製法の改良を行いメラトニン定量を妨害する様々な夾雑ピーク除去を検討した。本法で生成するメラトニン蛍光誘導体は比較的疎水性が高いと考えられるため、メラトニンを誘導体化反応した後、種々の有機溶媒を用いて溶媒抽出を試みた。その結果、酢酸エチル抽出を用いて効率的に夾雑物除去が可能であった。また、抽出操作の導入による定量再現性の低下を防止するため、適切な内標準物質を検討した。その結果、5-メトキシインドール-3-酢酸を用いた場合の日内、日間変動は共に2%程度であり、これが優れた内標準物質であることが明らかになった。
2)ミクロHPLCの導入によるメラトニン分析の高感度化
これまで申請者が開発してきた分離系を用いて予試験的にミクロカラムによるメラトニン分析を行った結果、高感度化は認められたがミクロカラムの劣化が極めて早く、再現的な分析が困難であった。そこでミクロカラムでの使用に適する移動相の検討を行った結果、0.01%TFAを含有するアセトニトリル水溶液を用いて再現的な分析が可能となった。種々の逆相ミクロカラムにおける検出感度を検討した結果、CAPCELL PAK C18-UG(1mm i.d.X15cm)を用いて従来の内径4.6mmのカラムを用いた場合と比較し約50倍の高感度化が達成された。
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