| 研究概要 |
1、野生型GPI-アンカー型糖蛋白質に会合する小胞体シャペロンの役割の解析
細胞としてはプリオン蛋白質を高発現しているヒトT98G細胞を用いた。T98G細胞を界面活性剤(NP-40)で可溶化後、まずプリオン蛋白質に対する抗体で免疫沈降し、さらにその沈降物を抗シャペロン蛋白質抗体(Bip,カルネキシン,カルレティキュリン)を用いてイムノブロットを行った。
また、カルネキシンおよびBipの作用を詳細に比較するため、それぞれの精製蛋白質を用い、in vitroで機能解析を行った。まず、GSTとの融合蛋白質として大腸菌で発現したカルネキシンを、第10a因子にてGSTと切断後、FPLCにて精製した。BipはヒスチジンタグをN末端に付け大腸菌で発現後、Niカラムにて精製した。精製したカルネキシンおよびBipは熱処理(43度-45度で60-90分間処理)等による糖蛋白質(Glc_1-Man_9-GlcNAc_2を持つ)および非糖蛋白質の変性による凝集塊形成を濃度依存的に阻害した。カルネキシンの作用は非糖蛋白質でBipと同程度、糖蛋白質ではBipに比べて数倍強力であった。さらにカルネキシンまたはBip存在下、熱処理して変性させた蛋白質は、BipおよびJドメインの作用により再び正常な立体構造に折り畳まれることをあわせて見いだした。以上の結果から、カルネキシンは新たに合成され未だ正常に折り畳まれていないプリオン蛋白質等の糖蛋白質と素早く結合することにより、これらの基質をfolding-competentな状態に保つこと、さらにBipおよびJドメインを持つ蛋白質がこれらの基質を正常な立体構造を取るように折り畳むというスキームが考えられた。
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