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大麻ポリケタイド合成酵素(OLAS)のcDNAクローニング
研究代表者は平成12年度に新規ポリケタイド合成酵素PKS1のcDNAクローニングに成功した。しかしながら大腸菌サイトゾルで発現させた組み換えPKS1は大麻成分のolivetolic acidではなく、その脱炭酸体のolivetolを合成した。この原因として発現システムが不適切であった可能性を考え、本年度は種々の発現システム(大腸菌ペリプラズム、酵母、植物発現系など)を用いて組み換え酵素を調製した。この結果、ペリプラズムで発現したPKS1が効率良くolivetolic acidを合成することを確認し、PKS1をolivetolic acid合成酵素(OLAS)と命名した。本酵素がサイトゾルとペリプラズムで異なる活性を示した原因については現在検討を行っている。
OLASの構造機能研究
OLASの構造機能研究を行うに当たり、X線解析を行うに十分な量の組み換え酵素が得られなかったため、モデリングにより立体構造の推定を行った。すべての植物ポリケタイド合成酵素に保存された数個のアミノ酸残基がOLASの活性部位と推定される領域に保存されていたことから、これらに点変異を導入してアッセイを行い、これらがOLASの反応にも重要な役割を果たすことを確認した。現在はOLASの活性部位のみに特徴的なアミノ酸への点変異導入を検討しており、これにより反応の特徴を決定するアミノ酸残基を決定する予定である。
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