| 研究概要 |
我々のこれまでの研究成果により,大腸菌抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系においては,PCR増幅したDNA断片を,そのままタンパク質合成の鋳型として利用できることがわかっている.これにより,目的DNA断片の発現ベクターへのクローニングという,従来生きた細胞を用いてタンパク質を発現する場合に必要であった煩雑な操作を経ることなく,目的DNA断片にコードされたタンパク質を調製することが可能である.
そこで,無細胞タンパク質合成系を核として,多数のDNAにコードされたタンパク質を,同時並行的に迅速に発現調製する,ハイスループットなタンパク質発現系の確立をめざして研究を進めた.
系の流れとしては,各々のcDNA断片に固有のプライマーセットを用いた1段階目のPCR反応と,発現調節配列(プロモーター,ターミネーター,SD配列など)や発現Tag配列を持つ共通プライマーセットによる2段階目のPCR反応を,引き続きおこない,発現用の鋳型DNA断片を作成する.次に,この鋳型を用いた無細胞タンパク質合成により,DNA断片にコードされたタンパク質を発現して解析する.
本年は,特に,様々な大きさの発現Tag配列を用いることが出来るように,PCRプライマーの配列や反応条件の検討を中心におこない,His-tag,GST-tag,CBD-tag,Thioredoxine-tag,MBP-tagといった各種発現tagを付加したタンパク質を,多数,同時並行的に発現するための条件を確立した.その上で,マウスのcDNAライブラリーの約700クローン(約1500コンストラクト)に関して,発現量や可溶性の解析をおこなった.
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