GFP-Rb融合蛋白質の生細胞における核内局在の検討

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12780534
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 武村 政春 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助手 (50303623)
• キーワード: Rb蛋白質 / 核小体 / 高リン酸化型 / ヌクレオフォスミン / B23 / 核小体分裂

研究概要

これまで癌抑制遺伝子産物Rb蛋白質の研究は、低リン酸化型の細胞増殖抑制能にのみ焦点が当てられて来たが、私はこの数年、高リン酸化型の細胞増殖への積極的機能分担の可能性を指摘して来た。昨年度は、GFP融合法を用いたRb蛋白質の細胞内局在の検討により、S期後期に高リン酸化型Rb蛋白質が核小体へ移行すること、その核小体移行にヌクレオフォスミン/B23(以下B23)が関与していることを報告した。本年度はその結果を受け、高リン酸化型Rb蛋白質の核小体移行メカニズムの更なる検討と、核小体移行の生物学的意義の解明を目指して研究を行った。まず、昨年度の研究において示唆された高リン酸化型Rb蛋白質とB23との相互作用について確認するため、アンチセンス法を用いてB23の蛋白質生成を阻害したところ、Rb蛋白質の核小体移行が抑えられた。また、HeLa細胞から核小体を単離し、その抽出液から抗B23抗体で免疫沈降を行ったところ、高リン酸化型Rb蛋白質が特異的に沈降することがわかった。これらのことは、高リン酸化型Rb蛋白質の核小体移行が、B23によって移行されることを強く示唆している。次に、高リン酸化型Rb蛋白質の核小体移行の生物学的意義について検討を行った。S期後期に核小体へ移行し、何かの役割を持つとすれば、最初に考えられるのはその先にある細胞分裂に先立つ核小体分裂nucleolar segregationにおける役割であろう。単離した核小体に、精製したB23と高リン酸化型Rb蛋白質を加えてインキュベートすると、核小体分裂が起こることを見出した。これはin vitroにおける両蛋白質の過剰存在下での実験であるが、高リン酸化型Rb蛋白質の核小体分裂への関与を示唆するものであり、極めて興味深い知見である。今後、更なる実験により検証していく価値があると考えている。

研究成果

• [文献書誌] TAKEMURA, Masaharu: "Stimulation of DNA polymerase α activity by cdk2-phosphorylated Rb protein"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 282. 984-990 (2001)
• [文献書誌] TAKEMURA, Masaharu.: "Poxviruses and the origin of the eukaryotic nucleus"J. Mol. Evol.. 52. 419-425 (2001)
• [文献書誌] UMEKAWA, Hayato: "The carboxyl terminal sequence of nucleolar protein B23.1 is important in its DNA polymerase α-stimulatory activity"J. Biochem.. 130. 199-205 (2001)
• [文献書誌] MIZUSHINA, Yoshiyuki: "Galactosyldiacylglycerol, a mammalian DNA polymerase α-specific inhibitor from a sea alga, Petalonia bingbamiae"Biol. Pharm. Bull.. 24. 982-987 (2001)
• [文献書誌] ITO, Yasutomo: "Structural requirements of sphingosine molecules for inhibition of DNA primase : Biochemical and computational analyses"Biochemistry. 40. 11571-11577 (2001)
• [文献書誌] Chikako MURAKAMI: "Vitamin A-related compounds, all-trans retinal and retinoic acids, selectively inhibit activities of mammalian replicative DNA polymerases"Biochim. Biophys. Acta. (in press).
• [文献書誌] Yoshiyuki MIZUSHINA: "A plant phytotoxin, solanapyrone A, is an inhibitor of DNA polymerase β and λ"J. Biol. Chem.. (in press).
• [文献書誌] Masaharu TAKEMURA: "Stimulation of DNA polymerase α by hyper-gravity generated by centrifugal acceleration"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 289. 345-349 (2001)