| 研究概要 |
ニワトリ6日目胚の網膜組織片を単独でコラーゲンゲル中で3次元的に培養すると放射状に軸索伸長が見られるが、網膜組織片をレンズと並べて同様に培養するとレンズ側に向かって伸びる軸索の伸長が著しく抑えられた。この結果からレンズは網膜内における極めて初期の軸索伸長に関与していることが明らかになった。レンズ由来の軸索伸長反発因子を同定するために、私はレンズ由来の反発分子が分泌型であることに注目して、酵母変異株を用いたsignal sequence trap法(Klein et al.,1996)を採用した。
得られたクローンのcDNAをプローブとして6日目胚のレンズ切片を用いてin situ hybridization法を行った。軸索伸長に対する反発活性が見られるレンズ上皮に発現する4つの新規cDNAフラグメントが得られた。レンズ由来のcDNAライブラリーをスクリーニングして全長cDNAの配列を決定した。4種類ともそのcDNA配列から新規の分泌型タンパク質であることが明らかになったので、それぞれのcDNAをpEF/MycA発現ベクターにサブクローニングした。COS細胞に発現させ、抗My-tag抗体によりwestern blotを行いタンパクの発現を確認した。
軸索伸長反発活性を検討するために、COS細胞に各々のcDNAを導入して強制発現させた。2日後にトリプシン処理を行い、Hanging drop法を用いて細胞塊を作成し、翌朝コラーゲンゲル中で6日目胚の網膜組織片と共培養したところ、網膜神経線維の伸長に反発活性を示す分子は無かった。
また、slit-2が嗅覚系の神経線維や運動ニューロンの軸索伸長に対して反発活性を持つと報告されたので、slit-1,2,3それぞれを用いて上記の様に機能解析を行ったが私達の実験系では反発活性を示す分子は無かった。
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