| 研究概要 |
1.受容体分子の分子量の予測
FLAGタグを付加した細胞死抑制因子のS14G変異合成ペプチド及びそれをI-125で標識したペプチドを用いて、無傷のF11細胞とインキュベーションした後、架橋剤を用いて結合蛋白と架橋させてから細胞膜分画を調製し、抗FLAG抗体により免疫沈降させる。沈降した蛋白をSDSゲル電気泳動を用いて分離し、分離した蛋白の移動度から、受容体蛋白の分子量を推定した。予備的検討で得られた130kDaに加えて新たに80kDaの分子が確認された。
2.ライブラリーのスクリーニング
これまでに、i)pEF-BOS,pCMV-SPORTベクターに組み込んだアルツハイマー病患者の大脳cDNA発現ライブラリー,ii)pEF1-MycHisベクター組み込んだマウス胎児大脳cDNA発現ライブラリーをCOS-7細胞にリポフェクション法とプロトプラストフージョン法を用いて導入し蛋白を細胞に発現させた。FLAGタグを付加した細胞死抑制因子のS14G変異合成ペプチドをプローブとしてパニング法により目的とする受容体遺伝子の濃縮を試みた。しかし、導入したベクターが組換えを起こしCOS-7細胞から直接回収が困難であることが判明したので、現在,pEF1-MycHisベクター組み込んだマウス胎児大脳cDNA発現ライブラリーを用いて、サブプールを作製しsiblingによりスクリーニングを鋭意続行中である。
|
