|
本研究では、油糧種子のうちナタネのタンパク質に焦点を絞り、まず第一にその主要成分であるクルシフェリンの高次構造をX線結晶構造解析で明らかにすることを目的として行った。ナタネから調製した天然のクルシフェリンは、少なくとも3種類のサブユニットから構成され多型性を有していることから、X線結晶構造解析が可能な結晶の調製は困難である。したがって、組換え型タンパク質のX線結晶構造解析を行うために、大腸菌を用いた発現系を構築した。登熟期ナタネ種子よりmRNAを精製し、RT-PCRによってクルシフェリンのcDNAをクローニングし、種々の発現条件を検討したところ、発現タンパク質であるプロ型クルシフェリンが、全菌体タンパク質の15%を占め、しかも可溶性タンパク質として得られた。得られた、発現系より組換え型プロクルシフェリンを精製するとともに変異体を作成し、結晶化と物理化学的性質を検討した。変異体は、分子内塩結合を形成する残基、遊離のシステイン残基、可変領域の置換および削除を行い、野生型プロクルシフェリンおよび天然のものと物理化学的性質を比較した。ナタネタンパク質のいまひとつの改質として、ダイズグリシニンを産生するナタネの作出も進めた。ナタネタンパク質よりも良質なダイズグリシニンを導入することで、ダイズタンパク質の優れた加工特性を付与することが期待できる。アグロバクテリウムを子葉柄に感染させて、形質転換体を得た後に種子でのグリシニンの発現をウエスタンブロッティングで確認した。F0世代からF1世代を得て、開花するまでに成長させることに成功した。
|
