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著者らは、呼吸鎖と過酸化物分解酵素を欠如する真性細菌(Amphibacillus)に過酸化水素と余剰酸素を同時に除去する新規の酵素系(NADH oxidase-AhpC系)を見い出した。本酵素系は非常に高い過酸化水素分解活性を有す。本申請はこの酵素系を葉緑体で発現させ、光合成反応中に生じた過酸化水素と余剰酸素の効率的除去による炭酸固定能の強化法開発を目的としている。本申請では、葉緑体モデル系としてランソウSynechocystis sp PCC6803を用いた。
1.ランソウのAhpC類似タンパク遺伝子のクローニングと発現 Synechocystis sp PCC6803の染色体DNAを調製し、PCRクローニング法によりAhpCタンパク類似遺伝子をクローニング後、発現ベクターpTrac99Aに導入し大腸菌にて発現させた。この大腸菌を多量培養し同タンパクを精製し、ランソウAhpCタンパクを取得した。
2.ランソウのAhpC類似タンパク電子伝達活性および、過酸化物分解活性の検討 細菌A.xylanus NADH oxidaseのランソウAhpCに対する電子伝達活性は低かった。しかし、ランソウの無細胞抽出液中にはランソウのAhpCとNAD(P)H存在下で、過酸化アルキルを分解する活性が検出された。以上のことから、ランソウでは、細菌と異なるタイプの酵素系がAhpCを還元し、A.xylanusのNADHoxidase-AhpC系をランソウで発現させた場合、これらの酵素は互いに競合しないことが示唆された。そこで同遺伝子系のランソウへの導入と発現を試みた。
3.ランソウSynechocystis sp PCC6803における遺伝子導入系の開発と導入 遺伝子導入系がすでに確立されているSynechocossus sp. PCC7942と大腸菌とのシャトルベクター(荷村、吉川 1998)を基にSynechocystis sp PCC6803染色体DNAの一部を組み込んだ同菌における遺伝子発現ベクターを構築した。これにA.xylanusのNADHoxidase-AhpC系遺伝子を組み込み、Synechocystis sp PCC6803に遺伝子導入した。スペクチノマイシン耐性をマーカーとして形質転換株を10^4/μgDNA得たが、NADHoxidase-AhpC系遺伝子の発現は見られなかった。
A.xylanusのNADHoxidase-AhpC系を含むベクターのランソウへの導入に成功したが、遺伝子発現に至らなかった。タンパク発現系を再構築後、同遺伝子の発現を試みる予定である。
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