ニセツリガネゴケの高頻度相同組換え能を利用した葉緑体ゲノムの機能改変

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12874107
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 杉田 護 名古屋大学, 人間情報学研究科, 教授 (70154474)
• 研究分担者: 青木 摂之 名古屋大学, 人間情報学研究科, 助手 (30283469)
• キーワード: ヒメツリガネゴケ / 葉緑体 / 葉緑体形質転換 / シグマ因子 / 核遺伝子 / 細胞内局在

研究概要

葉緑体DNAに存在するtRNA遺伝子のいくつかは機能していない「痕跡遺伝子」であるという仮説を検証するため、ニセヒメツリガネゴケ(正式和名ヒメツリガネゴケ)Physcomitrella patensの葉緑体tRNA遺伝子のうち、その候補となるtRNA^<Arg>をコードするtrnR-CCGをノックアウトする。また、ニセツリガネゴケの葉緑体形質転換系を確立する。
(1)ヒメツリガネゴケ葉緑体DNAに存在するrbcL遺伝子とaccD遺伝子の間に、高等植物の葉緑体DNAには存在しないtrnR-CCG遺伝子が存在する。trnR-CCG遺伝子をノックアウトするため、同遺伝子を選択マーカー遺伝子(aadA)で置換したプラスミドを作製し、これをヒメツリガネゴケのプロトネマプロトプラストにポリエチレングリコール存在下で導入した。抗生物質スペクチノマイシン(Spc)存在下で生育可能な多数のSpc耐性株を得た。これらのSpc耐性株が葉緑体形質転換株であることをゲノム解析により確認した。
(2)ヒメツリガネゴケの葉緑体シグマ因子をコードする2種のcDNAを取得し、それぞれをPpSIG1とPpSIG2と命名した。PpSIG1は579アミノ酸、PpSIG2は354アミノ酸からなるシグマ因子をコードしていた。これらの葉緑体シグマ因子をノックアウトすることにより、葉緑体遺伝子の発現に及ぼす影響を調べる準備が完了した。
(3)ファージ型RNAポリメラーゼをコードする核遺伝子を取得した。同遺伝子を破壊するためのコンストラクトを作製した。

研究成果

• [文献書誌] Sugita,C.,Sugiura,M.,Sugita,M.: "A novel nucleic acid-bindingprotein in the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC6301 : a 33 kDa soluble polypeptide with high sequencesimilarity to ribosomal protein S1."Mol.Gen.Genet.. 263. 655-663 (2000)
• [文献書誌] Yukawa,Y.,Sugita,M.,Choisne,N.Small,I.D.,Sugiura,M.: "The TATA motif, the CAA motif and the poly (T) transcription termination motif are all important for transcription re-initiation on plant tRNA genes."The Plant J.. 22. 439-447 (2000)
• [文献書誌] Nakamura,T.,Ohta,M.,Sugiura,M.,Sugita,M.: "Chloroplast ribonucleoproteins function as a stabilizing factor of ribosome-free mRNAs in the stroma."J.Biol.Chem.. 276. 147-152 (2001)
• [文献書誌] Hara,K.,Sugita,M.,Aoki,S.: "Cloning and characterization of the cDNA for a plastid sigma factor from the moss Physcomitrella patens."Biochim.Biophys.Acta. 1517. 302-306 (2001)
• [文献書誌] 杉田護: "色素体遺伝子の転写を支配する核ゲノム"プレインテクノニュース. 79. 22-24 (2000)