概日リズムのPDHペースメーカーホルモン受容体の発現クローニング

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12874115
• 研究機関: 福岡大学
• 研究代表者: 下東 美樹 福岡大学, 理学部, 助手 (60078590)
• 研究分担者: 下東 康幸 九州大学, 大学院・理学研究院, 教授 (00211293)
• キーワード: 概日リズム / ショウジョウバエ / PDHペプチド / 脳内結合タンパク質 / 受容体

研究概要

甲殻類の色素拡散ホルモンとして当初発見された神経ペプチドPigment-Dispersing Hormone(PDH-)が一連の節足動物、昆虫で相次いで単離・同定され、近年、概日リズムのペースメーカーペプチドであることが強く示唆されている。
PDHの受容体を同定し、概日リズム発現の分子機構を明らかにするために、特有の内在性PDHペプチドを持ち、概日リズムの発現が明らかなショウジョウバエについて、下記の実験を遂行し、成果を得た。
(1)PDHペプチドの化学合成および放射ラベル誘導体の調製
ショウジョウバエのPDH(18-ペプチド)およびトリチウムによる放射標識が可能な前駆体として、デヒドロロイシン(ΔLeu)を4位に含むPDHアナログを化学合成した。この前駆体ペプチドについて、3H2ガスによるトリチウム標識を実施(アマシャム社に依頼)して[3H]PDHを合成した。測定の結果、ロイシン残基にトリチウム原子7個が導入された放射標識ペプチドがHPLCで単一画分として得られた。
(2)[3H]PDHを用いた脳ホモジネートに対する結合試験
得られた[3H]PDHをトレーサーとして、ショウジョウバエ脳ホモジネートに対して結合試験を実施し、特異的結合の測定を試みた。その結果、結合タンパクの存在を示唆する結果が得られた。しかしながら、試料によって十分な再現性を得ことができていないため、現在詳しい条件検討を行なっている。
(3)PDHペプチドに対する脳内結合タンパク質(受容体)の発現クローニング
ショウジョウバエ頭部のcDNAライブラリーを、国際研究機関であるBerkeley-Drosophila Genome-Projectより入手した。現在、これを培養真核細胞に形質導入するため、条件等を検討している。今後、機能発現クローニングにより、PDHペプチド受容体のクローニングを試みる予定である。また、他の時計タンパク質のクローニングも併せて行ない、それらとPDHとの相互作用についても検討してゆく。

研究成果

• [文献書誌] Meinertzhagen I.A.& Shimohigashi M. et al: "Photoreceptor phenotypes for Drosophila mutants nonC and hdcjk910."Abstract for Canadian Siociety of Zoologist. 31(2). 7 (2000)
• [文献書誌] Shimohigashi M. et al.: "Molecular cloning and gene expression of a circadian neuropeptide, PDF, in the cricket Gryllus bimaculatus."Comp.Biochom.Physiol.. 127. 374 (2000)
• [文献書誌] Tomioka K.& Shimohigashi M. et al: "Immunohistochemical demonstration of Gryllus PDF,a bioactive peptide isolated from the brain of the cricket Gryllus bimaculatus."Comp.Biochem.Physiol.. 127. 374 (2000)
• [文献書誌] Chuman Y.& Shimohigashi M. et al: "cDNA cloning of circadian rhythm pacemaker neuropeptide PDF in Gryllus bimaculatus and its nuclear localization."Peptide Science 2000. 59-62 (2000)
• [文献書誌] Matsushima A.& Shimohigashi M. et al: "Gene expression of a circadian pacemaker hormone peptide PDF in cricket Gryllus bimaculatus."Peptide Science 2000. 63-66 (2000)