ハイスループットモノクローナル抗体取得法に関する研究

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12875153
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 中野 秀雄 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助教授 (00237348)
• キーワード: 無細胞タンパク質合成系 / Fab / 触媒抗体 / PCR / 逆転写 / ハイブリドーマ / モノクローナル抗体 / 1細胞RT-PCR

研究概要

これまで抗体分子で無細胞タンパク質合成系による報告があるものは、L鎖とH鎖の可変領域(Fv)を人工的なリンカー配列で結合させた単鎖Fvだけであった。本萌芽研究の成果により、無細胞タンパク質合成系の反応条件を最適化することで、H鎖L鎖の定常領域をするFab断片の合成に成功した。用いたFabはエステラーゼ活性を有する触媒抗体であり、無細胞系で合成されたものは、L鎖とH鎖との間で分子間のジスルフィド結合を有し、ハイブリドーマより合成されたものと同等の結合認識能力および触媒活性をしていた。一般にモノクローナル抗体を組み換え微生物で発現させる場合、単鎖Fv化すると本来の機能が損なわれることがあること、またFabの方が単鎖Fvより構造的に安定であることが知られている。今回2本のペプチド鎖をコードする遺伝子から、直接活性を有する抗体断片を試験管内の反応で合成できたことの意義は大きい。
一方マウスのL鎖cDNAを大部分増幅できるような縮重プライマーを設計した。これを用いて上記Fab遺伝子の転写mRNA約1分子からのRT-PCRによる増幅に成功した。さらに全く別の抗体を産生するハイブリドーマ1細胞より、逆転写反応とPCR反応を連続的に行い、抗体のL鎖遺伝子(cDNA)を増幅することに成功した。今後ハイブリドーマ細胞ではなく、B細胞からの増幅や、L鎖H鎖の同時増幅が可能になれば、ハイブリドーマ法に代わる手法となることが期待される。

研究成果

• [文献書誌] Jiang, X., Oohira, K., Iwasaki, Y., Nakano H., Ichikawa, Yamane, T.: "Reduction of protein degradation by use of protease-deficient mutants in cell-free protein syntheis system of Escherichia coli"Journal of Bioscience and Bioengineering. 93(2). 111-116 (2002)
• [文献書誌] Jiang, X., Nakano H., Ookubo, Y., Fujii, I., Yamane, T.: "Expression of Fab fragment of catalytic antibody 6D9 in an Escherichia coli in vitro coupled transcription/translation system"FEBS Letters. (in press).